Western Blot 原理簡介

2021-02-19 醫學僧的科研日記
Western Blot，即蛋白質印跡法（免疫印跡試驗），其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。

電泳

轉膜

封閉

抗體

顯影

  1. SDS-PAGE電泳  

SDS-PAGE：SDS(十二烷基硫酸鈉)聚丙烯醯胺凝膠電泳

*SDS作用：

①使未變性的蛋白延展為鏈狀

②SDS是帶負電荷的，與蛋白結合後也使蛋白呈負電荷

在電場作用下，蛋白從負極向正極遷移。分子量小的跑得快，最終在膠的底部；分子量大的跑的慢，最終在膠的頂部。

  2. 轉膜   

為什麼要轉膜？

①對應分子量的條帶未必一定就是要檢測的目標蛋白，需進一步抗體檢測；

②膜對蛋白具有高度親和力，易沾染蛋白；將蛋白從膠中轉移的膜表面，利於進一步與抗體結合。

常用膜：

硝酸纖維素膜、PVDF(聚偏氟乙烯)膜


轉膜原理：

在電場作用下，帶負電的蛋白向正極遷移，從SDS膠中轉移並結合到膜上；與膜結合時，蛋白脫離SDS失去負電荷，停止遷移。

轉膜的配置及作用：

① 結構如圖：

② 部分物品的作用：

海綿：固定整個轉膜系統

濾紙：維持transfer buffer的穩定流動

*transfer buffer中加有甲醇，可促使蛋白與SDS分離

在此轉膜系統中，在電場作用下蛋白即遷移並結合到膜上，用於進一步免疫學檢測。

  3. 封閉   

為什麼要封閉？

膜對蛋白具有高度親和力，故必須封閉膜上的空白位點，以防止抗體與膜直接結合，即阻止非特異性結合。

常用：脫脂牛奶或BSA

  4. 加抗體   

① 加一抗（能與目標蛋白特異性結合）孵育：

② 清洗掉多餘的一抗：

③ 加二抗（標記抗體）孵育：

④ 清洗掉多餘的二抗：

  5. 顯影   

二抗上帶有辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP），加入該酶的底物時， 可引起化學發光，使目標蛋白對應的條帶顯影。如下圖所示：

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