Western blot（蛋白印跡）是科研研究中最為平常的實驗，但卻蘊含了很多知識。儘管我們在接觸該實驗時都會被虐的體無完膚，但卻秉承著「WB虐我千百遍，我卻待它如初戀」的精神一直和WB鬥智鬥勇。現在就把各位前輩做WB的各種經驗總結起來，希望對大家能有所幫助。
WB的一般流程
一、 蛋白的提取
經驗總結：
1：提取蛋白質過程中，應在低溫環境下進行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入適合的蛋白酶抑制劑）。
2：蛋白樣品建議分裝後冷凍乾燥或直接以液體態置-80℃中保存，不要反覆凍融。
3：蛋白濃度低時，可使用超濾膜濃縮或者用真空凍幹機將蛋白凍幹。
二、電泳
經驗總結：
1：配膠時各種試劑一定要混合均勻。
2：APS在-20℃可以長期保存，在4℃保存不要超過一周。
3：上樣時：根據蛋白表達豐度調整蛋白上樣量，儘量保證每孔上樣量保持一致。
4：為了檢測整個實驗系統或校準實驗結果，需要設置內參（一般指由管家基因編碼表達的蛋白）。
三 、轉膜
用於western blot的雜交膜主要有兩種：NC膜和PVDF膜，可依據目的蛋白與膜的結合能力及膜的孔徑來挑選不同的轉移膜。轉膜方法分為溼轉法和半乾轉法，兩種方法各有利弊。溼轉轉膜效率最佳，但浪費試劑和溶液且費時；半乾轉省時、省試劑但更適合轉印分子量較小的蛋白。下圖是半乾轉的模擬圖。
經驗總結：
1：膠在負極，膜靠近正極；濾紙不要大過膜，防止短路。
2：夾好膜和凝膠後，確定在凝膠、膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導致轉膜不完全。
四、封閉
常見的封閉液有5%脫脂奶粉、BSA和Western Blot膜封閉液（生物試劑公司提供）。封閉液的選取可結合實驗室具體情況而定。
五、抗體孵育
一抗的孵育是WB實驗過程中的核心步驟。抗體的使用是一種藝術，一種抗體一個脾氣。選擇抗體時，一方面需要考慮所選抗體是否能識別凝膠電泳後轉印至膜上的蛋白，另一方面需要考慮所選抗體是否會引起交叉反應條帶，以免出現非特異性條帶。一抗通常4℃孵育過夜，二抗通常1:5000-1:10000稀釋，室溫孵育1-1.5h，洗膜通常選用TBST，洗滌時間一般為10min，洗滌3次。
六 、底物顯色
將NC膜或PVDF膜置於保鮮膜上，加入適量的發光液，在暗室曝光或者移入凝膠分析儀中顯影。
七 、WB結果定量分析
WB做完後，可採用圖像處理軟體ImageJ對結果進行灰度分析。
八 、WB示例解析
如下圖所示，目的條帶單一，內參均一就是理想中的WB結果。