Western blot竅門分享

2020-12-06 騰訊網

做了兩年半的Western blot，真的是遇到了太多不可思議的、解決不了的問題，猶記得剛進實驗室的時候，學會了WB像是學會了全世界，殊不知這只是科研實驗的一塊小磚頭，如今快要畢業了，還在每天跑著WB補實驗。今天在這裡跟大家分享一些做WB的小竅門，不一定有科學原理支撐，但卻能讓你節省時間，跑出完好看的條帶。

一、蛋白提取

1、不管你提取的是組織蛋白還是細胞蛋白，RIPA裂解液和PMSF都是必不可少的使用試劑。常規情況下，我們從試劑公司購買的RIPA都是100ml的體積，但就算是提取組織蛋白也就只用500-800ul，那麼即便你身處一個大實驗室，一瓶RIPA也可以用上至少一個學期。所以建議大家根據個人使用量將RIPA分裝保存，避免反覆凍融，但是不要將PMSF和RIPA混合後再分裝，這樣會影響PMSF的作用效果。（參考推文：Western blot提取蛋白時DTT和PMSF等蛋白酶抑制劑你真的了解嗎？蛋白怎麼煮最合適？）

2、loading buffer的主要作用是指示蛋白、沉降蛋白，所以在煮沸蛋白之前，都需要根據蛋白的體積計算好1*loading buffer的量，二者充分混合後煮沸5分鐘。但是很多新手都會忘了loading buffer的另一個作用——還原劑。如果沒有加loading buffer又或者加入量不足，無法使蛋白質的二硫鍵充分打開，影響蛋白質的遷移率。所以如果你遇到明明應該是一條蛋白條帶，發光後卻是兩條，那你不妨試試適當多加一些loading buffer，加入量可按蛋白的五分之一來算。

二、製備分離膠和濃縮膠

1、如果你夠細心會發現，不同濃度的分離膠主要區別在丙烯醯胺和水的比例上面。30%的丙烯醯胺主要的作用就是構成三維網狀的凝膠使得不同分子量的蛋白在電泳過程中區分開。所以可想而知丙烯醯胺在制膠中起到的作用有多大。之前在網上看到過有同學說，為什麼使用不同廠家的丙烯醯胺，蛋白的分子量會有很大差異，問題很有可能就是出在丙烯醯胺的身上，即便30%丙烯醯胺的官方配比是如此，不同廠家的質量還是會不同。所以，建議大家在同一廠家購買丙烯醯胺，同時注意4度避光保存。因為丙烯醯胺具有神經毒性，不建議各位自己配製。

2、小六兒所在的實驗室，WB是個走量的活兒。因為只有一個電泳儀的的電源，所以每天三臺電泳儀需要重複跑三輪。所以很多時候為了節省時間，分離膠和濃縮膠的凝固時間都不是很充足。這樣做的弊端就是即使視覺上乙醇壓平了分離膠液面，拔出梳子後各個孔隙已經形成，但是分離膠和濃縮膠還沒有形成穩定的三維網狀結構就已經開始跑上蛋白了：

a) 蛋白條帶是波浪型而不是直線；

b) 同一時間下各組蛋白不在一條直線上，分子量不準；

c) 下部的分離膠凝固不均勻，條帶直接跑花了；

d) 濃縮膠沒有凝固充分，蛋白沒有充分壓縮，主要影響到小分子量的蛋白條帶曝光後會特別粗。

（蛋白跑花）

（壓縮不充分）

所以，即使這是個走量的活兒，但它也是個細節決定成敗的活兒。分離膠和濃縮膠凝固後，最好讓其在室溫下穩定1-2小時，再進行下一步，心急吃不了熱豆腐。

三、機器維修和維護

新時代對研究生的要求是：不僅要會做實驗，還要會修機器。上一段小六兒說道，因為本人所處的實驗室WB很走量，這也就導致了WB的相關機器損耗的很厲害，每學期平均要修理2-3次，大部分問題都出在正負電極頭腐蝕折斷或連接正負電極的電線燒斷。

a) 每次做完WB清洗機器的時候，玻璃板可以用自來水衝洗，但是機器本身最好使用三蒸水清洗；

b) 機器長時間使用，會在機器本身產生很多鏽跡，這時候可以用棉籤蘸取鹽酸進行擦拭。擦拭掉鏽跡後再用三蒸水衝洗；

c) 機器也要避光放置，不要被陽光直射；

d) 機器使用年頭過長，鏽跡或者本身老化的原因，都會使機器的電阻變大，所以你也可以通過觀察顯示屏上電流的大小判斷機器的好壞。儘量不要將老化的機器和新機器放在同一個電源下跑WB，這樣只會縮短新機器的使用壽命。

最後給大家分享一個實驗好物：快速轉膜液。我們平日配製的轉膜液需要添加甲醇，轉膜時間根據分子量不同1-3小時不等，同時還要保證轉膜處於低溫條件下進行。現在很多試劑公司都推出了快速轉膜液，用乙醇配製，30分鐘即可完成轉膜，並且不用控制轉膜時的溫度，效果很好用，性價比很高。

以上就是本人總結的一些WB小竅門，祝福各位都能順利快速做完WB！

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