Western Blot 之組織蛋白裂解及測定操作步驟

2021-01-15 解螺旋

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作者：螺絲釘Fiona

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　　大家在做動物實驗的時候經常會需要利用大鼠組織進行Western Blot檢測目的蛋白或者相關蛋白表達量差異情況，今天我就以腦組織為例說說這組織蛋白裂解及測定的具體操作步驟，都是師兄師姐的吐血總結，大家可以參考一下！


一、取材：


1、所用物品：剪刀、骨鉗、彎鑷、託盤、濾紙、凍存管、液氮罐、-80℃冰箱、冰盒、marker筆


2、所需試劑：10%水合氯醛


3、步驟：


① 10%水合氯醛腹腔麻醉致死，斷頭取腦，將大鼠腦子剝離後放入託盤內（託盤內鋪上一張濾紙），然後將大鼠腦子表面的血管絲剝離乾淨。


②取目標腦組織分裝在凍存管中。[注]第①、②步必須在冰盒內操作，防止蛋白降解。


③ 將凍存管用marker筆編好號後迅速凍到液氮中，使其迅速冷凍，然後再凍到-80℃冰箱備用。[注]為了以防溫度驟降，凍存管炸開，從液氮中取出標本時，要緩慢拿出，一般1min/cm，在出瓶口時再緩幾分鐘，拿出後迅速放入裝有碎冰的盒內，再放到-80℃冰箱。


二、蛋白測定


1、所用物品：天平、-80℃冰箱、冰盒、鑷子、小剪刀、超聲波細胞粉碎機、濾紙、天平、5ml離心管、1.5ml離心管、冰盒、小燒杯、加樣器、Tip頭、離心機、比色杯、分光光度計、水浴鍋。


2、所需試劑：組織蛋白裂解液（ddH2O、SDS、EDTA 、Tris鹼、Triton×100、Leupeptin、異丙醇、PMSF、濃鹽酸、甘油、DTT、吐溫20）、ddH2O、BSA、工作液的A液和B液、SDS、EDTA 、Tris鹼、Triton×100、Leupeptin、異丙醇、PMSF、濃鹽酸、甘油、DTT、吐溫20。


3、步驟：


（1）稱重：從-80℃冰箱內取出標本，在冰浴內融化，然後稱重。先稱5ml離心管，然後再將樣品從凍存管中取出放入離心管中，稱出總重量。算出樣品重量（樣品重量=[（離心管+樣品）－離心管重]），分別標好號後記錄在紙上。


（2）蛋白提取：冰浴內進行


①　向標本中加入冰冷的組織蛋白裂解液，按樣品重量：組織蛋白裂解液=1：4（g=ml）或按樣品重量：組織蛋白裂解液=1：5（如蛋白濃度較高時，可1：5稀釋，通常蛋白濃度，按1：4稀釋）。


②　將樣品用小剪刀剪碎[註：每剪完一個樣品，需用ddH2O衝洗一下剪刀並用濾紙吸乾淨。


③　用超聲波細胞粉碎機勻漿：

插上電源→將測溫探頭放入盛有冰水混合物的小燒杯內→打開電源按鈕→按「Enter」鍵設置時間，總時間2min，超聲開9.9S，間歇30S，溫度2~4℃→然後再用ddH2O衝洗探頭，用濾紙吸乾，將探頭插入裝有樣品的5ml離心管中，（將5ml離心管放入盛有冰水混合物的小燒杯內）→按開始鍵進行超聲破碎。


[注]：

ａ）每超聲完一個樣品，都需用ddH2O將探頭衝洗乾淨，濾紙吸乾後再行下一個樣品；

ｂ）為了防止按下開始鍵後由於慣性勻漿液濺出，可以先按開始鍵後再將探頭緩慢插入離心管中。


④　將超聲完的組織放在冰浴內，靜止裂解30min，（剛超聲完的樣品上邊的沫子靜止後可以減少同時增加蛋白的溶出）。


⑤　預冷離心機使其溫度達到4℃（要預先打開30min）。


⑥　將超聲靜止後的標本用槍將裂解液移至1.5ml的離心管中，然後在天平稱重，配平後4℃，13500rpm/min，離心10min。


⑦　離心完後取上清，入新的1.5ml EP管中。


⑧　將剩下的沉澱再加入1倍體積的裂解液混勻，4℃，13500r/min，離心10min，取上清入第5步的管內，第5和第6步的上清為腦組織總蛋白提取液。


⑨　將腦組織總蛋白提取液按BCA-kit說明檢測蛋白含量。然後根據蛋白含量分裝成一次western blot所需量（µl/每管），備用。


[注] 如當天或一周內要做，可以先變性（加laoding buffer）後，放在4℃保存；如果短期內不做，則要凍在-80℃冰箱。


另：離心後剩下的沉澱也要再加勻漿液，再次勻漿，這樣可以節省樣品。


（3）蛋白測定（BCA法測蛋白）


①　標準蛋白的配置（工作範圍20-2000µg/ml）



稀釋液體積（ddH2O）/µl

BSA體積/µl

BSA濃度（µg/ml）

A

0

300

2000

B

125

375

1500

C

325

325

1000

D

175

175µl的B液

750

E

325

325µl的C液

500

F

325

325µl的E液

250

G

325

325µl的F液

125

H

400

100µl的G液

25

I

400

0

0

（一般用ddH2O來調0，一般範圍做到2000µg/ml）



②　工作液=A液：B液=50：1

工作液總量=（m個樣品+n個標準品）* 200µl

工作液：樣品=20：1 （一般每個樣品工作液需加200µl）


③　開37℃水浴鍋，預溫30min。


④　每管加入工作液200µl，標準品10µl；


取2ul樣品，18ulDDH2O，混勻後再從其中取10ul加入到200ul的工作液中。


⑤　開分光光度計，預溫30min。


⑥　將標準品和樣品放在水浴鍋中37℃加熱30min，冷卻至室溫後用分光光度計比色。


⑦　將分光光度計波長選在562nm處進行比色。比色時先比標準品（先調0，從低向高比），注意每比完一個樣品後用DDH2O洗淨濾紙吸乾後，再比下一個。。


⑧　得出標準曲線以及標準蛋白的吸光度、濃度以及樣品的吸光度、蛋白濃度，然後用excel表格處理。


A

B

C

D

E

F

標準品吸光度

標準品濃度（µg/ml）

樣品吸光度

樣品濃度（µg/ml）

稀釋10倍前樣品真正濃度（D*10）

100µl的樣品需加勻漿液量


把A、B值輸進去後選中A、B組→點統計圖表→選xy點圖→下一步→下一步→完成→在圖中激活各點按右鍵→添加趨勢線→選項→選公式+R值平方→確定→得出公式y=mx+n，R2=→再將C值代入x得出y值即是D值→E值=D值*10→F值=（E/最小蛋白濃度-1）*100µl

G（µl）=樣品總體積= F +100µl


H=需加變性液（loadingbuffer）量=G/3


I=取15µl樣品，所含的蛋白量=最小蛋白濃度(ug/ml/1000)=[(最小蛋白濃度µg/µl)*100]/[（G+H）*15µl]


一般20µl左右蛋白應在50-60µg。


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