Western Blot 蛋白樣品的定量方法選擇

2020-11-21 中國教育裝備採購網

　　Western Blot 技術交流第一期內我們通過裂解細胞，組織等步驟已經把蛋白提取出來，但提出來後要怎麼知道提出的效果怎麼樣，怎麼才能在同等量上上樣。這就需要進行蛋白定量，目前用得最多的定量方法有兩種，一種是 BCA 法，一種是Bradford 法。下面我們詳細介紹下這兩種定量方法的原理與優缺點：


　　BCA 法：

　　BCA 蛋白定量法是目前廣泛使用的蛋白定量方法之一。其原理是在鹼性環境下 蛋白質分子中的肽鏈結構能與 Cu2+絡合生成絡合物，同時將 Cu2+還原成 Cu+。BCA 試劑可敏感特異地與 Cu+結合，形成穩定的有顏色的複合物。在 562nm 處有高的光

　　吸收值，顏色的深淺與蛋白質濃度成正比。使用本試劑盒檢測靈敏度高，對不同種類蛋白質檢測變異係數小，操作簡單。

　　Bradford 法：

　　Bradford法是最簡單和快速的比色蛋白定量方法。這一方法基於考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合後，產生藍色化合物，反應迅速而穩定。反應化合物在 465-595 nm 處有最大的光吸收值，化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關係，因此可檢測 595 nm 的光吸收值的大小計算蛋白的含量。

　　BCA 法

　　優點 1. 準確：變異係數遠小於考馬斯亮藍染色法(bradford 法)

　　2. 線性範圍寬，檢測靈敏，檢測範圍：20-2000 μg/ml

　　3. 與金屬離子、還原劑和螯合劑、去汙劑兼容性好

　　4. 質量檢測標準曲線線性關係 R2 值一般為 0.998

　　缺點 1. 與 Bradford 法相比不能迅速檢測，需要 37℃孵育 30 min。

　　Bradford 法

　　優點 1. 與 BCA 法相比，使用本產品反應迅速，即加即檢

　　2. 靈敏度範圍為 100-1500 μg/ml

　　3. 質量檢測標準曲線線性關係 R2 值一般 0.980

　　缺點 1. 與金屬離子、還原劑和螯合劑、去汙劑兼容性差

　　2. 精確度沒有 BCA 法高

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  • Western-blot整個實驗過程中的原理全在這裡
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