Western Blot中隱藏的生化危機II:樣品製備

2020-12-04 生物谷

Western Blot又稱為蛋白質印跡，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的基於抗體抗原之間特異免疫反應的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。

其基本原理為：聚丙烯醯胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質樣品分離，分離後的蛋白被轉移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標蛋白，通過酶促反應或者化學發光等方法將目標蛋白可視化，從而對蛋白進行定性或者定量研究。

"良好的開始是成功的一半"，尤其對於生物學實驗，如果沒有高質量的實驗樣本，等待我們的很可能是失敗的實驗結果。優質特異的蛋白樣品對Western Blot實驗至關重要。下面將從蛋白樣品製備的方法和試劑選擇上給大家一些建議，同時也和大家分享一些因蛋白樣品製備不當而導致Western Blot實驗失敗的案例。

蛋白樣品製備的基本原則

目的蛋白因其物種來源和組織特異性的不同，在種類和性質上有很大差異，因此並沒有一種製備方法可以適用於所有蛋白的提取。這就需要我們進行全面的分析後才能選擇最合適的蛋白製備方法，在這個過程中遵循的一個基本原則是"知己知彼"。

首先，"知己"是要了解：樣品是來自什麼物種？目的蛋白定位在哪種組織或細胞器？是可溶蛋白還是不可溶蛋白？是高豐度蛋白還是低豐度蛋白？在製備時需要保持蛋白的天然活性，還是需要變性蛋白？

其次，"知彼"是要知道：哪種方法或試劑能夠防止蛋白降解、聚集、沉澱、變性、修飾？哪種能夠去除高豐度蛋白幹擾，富集低豐度蛋白？哪種能去除核酸、多糖、脂肪等雜質？哪種能在有限的實驗條件下，簡便快速地獲得高純度且完整性好的蛋白？

遵循"知己知彼"的原則對蛋白樣品製備進行全面分析，就能明確蛋白樣品製備的合適方法或試劑。

細胞組織裂解液的選擇

裂解液是最普遍使用的蛋白提取試劑，可根據文獻或經驗自行配製，也可購買商業化的產品。常見的細胞裂解液有NP40、Triton X-100、RIPA buffer等。下表是根據目的蛋白的不同定位選擇裂解液的建議。雖然裂解液的使用範圍比較廣泛，能夠滿足總蛋白的提取，但是無法做到特異蛋白的提取，特別是遇到低豐度蛋白或者活性蛋白功能分析時，通用型的裂解液存在很大的局限性。

蛋白抽提試劑盒的選擇

蛋白抽提試劑盒的出現彌補了細胞裂解液的應用局限性，特別是針對難提取的樣本或者亞細胞器蛋白的提取，例如：針對植物、動物組織/細胞、細菌、酵母等不同樣品及細胞核、細胞膜、線粒體、葉綠體、溶酶體等不同亞細胞器的專業提取試劑盒。這類特化試劑盒能夠針對目的蛋白的不同來源和不同組織定位進行裂解和提取，簡化實驗操作的同時還能提高蛋白提取的得率。

以Sigma公司的CelLyticTM系列蛋白提取試劑盒為例：一方面，該系列試劑盒有非變性的裂解配方，可最大程度地保留蛋白活性；另一方面，該系列產品無需經過反覆凍融、超聲破碎等傳統物理裂解方法，並能在很短時間內得到高純度的蛋白。如：膜蛋白提取試劑盒（CE0050），通過非變性裂解配方，只需20-30分鐘即可得到具有天然活性的多層跨膜蛋白，且能夠有效地去除多糖、核酸等雜質。

此外，Sigma公司還提供一系列從生物樣品中去除高豐度蛋白，富集低豐度蛋白的解決方案。Seppro®系列產品通過與多種雞來源IgY多克隆抗體的免疫親和吸附作用，可將樣品中的蛋白質進行高度特異性的區分，從而達到富集低豐度蛋白的目的。它可以從人類的血清或血漿樣品中去除14種高豐度蛋白。此外，Seppro®產品線還能覆蓋對小鼠和大鼠樣品的處理，以及從植物樣品中去除二磷酸核酮糖羧化酶。該類解決方案能顯著降低樣品的複雜性，利於低豐度蛋白的下遊檢測。

Western Blot中的蛋白樣品危機

在Western Blot中如果蛋白樣品製備不當，可能會造成無信號、弱信號、條帶大小不正確等實驗問題。下表就此類實驗問題給出案例分析和解決方案，供參考。

以上是關於Western Blot實驗過程中如何選擇合適的蛋白製備方法和試劑的一些建議，以及由於蛋白樣品製備不當造成實驗失敗的問題總結，希望能給大家一些幫助和啟發。此外， Western Blot還有很多關鍵的實驗環節需要注意，比如怎樣選擇高質量的抗體、怎樣保護蛋白樣品不被降解、怎樣配製合適的SDS-PAGE凝膠等，在之後的篇章裡會逐步為大家介紹。(生物谷Bioon.com)

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    ，編輯了這份 western blot 操作步驟，內容包括主要操作步驟和所需要注意的有用的細節，並附上參考文獻。蛋白質的樣品製備是 Western Blotting 的第一步，樣品製備是關鍵步驟，要求儘可能的獲得所有蛋白質，應注意以下問題：在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質的最大溶解性和可重複性。選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結合的蛋白質複合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。儘量去除核酸，多糖，脂類等幹擾分子。
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