Western Blot中隱藏的生化危機I:抗體選擇

2020-11-28 生物谷

Western Blot又稱為蛋白質印跡，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的基於抗體抗原之間特異免疫反應的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。

其基本原理為：聚丙烯醯胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質樣品分離，分離後的蛋白被轉移到固相支撐物（雜交膜）上，抗體特異性識別目標蛋白，通過酶促反應或者化學發光等方法將目標蛋白可視化，從而對蛋白進行定性或者定量研究。

抗體與抗原之間的特異性識別是Western Blot實驗中最為關鍵的一個步驟，選擇的抗體是否合適、抗體的質量優劣都關乎實驗的成敗。下面將從高品質抗體的選擇、驗證數據對抗體的重要性及內參抗體的選擇標準等方面給大家一些建議。

質量是甄選優質抗體的首要標準

2015年，刊登在Nature的一篇文章深度闡述了目前抗體試劑的現狀與問題，給全世界科研工作者敲響了警鐘。當抗體試劑遭遇信任危機，我們更應深刻反思：如何才能獲得高質量、合適的抗體試劑。(查看全文)

市面上常見的抗體有進口品牌、國產品牌、進口品牌國內分裝這幾種類型。大部分進口品牌在抗體的質量、特異性、效價及保存條件方面較有保障。而有些國產品牌的抗體，在做Western Blot時，由於其特異性不高，導致實驗結果出現背景不乾淨，非特異性條帶多等問題。進口品牌國內分裝則是個別經銷商從廠家買到產品後，再通過稀釋、分裝、重新貼牌之後賣給客戶，這樣的抗體雖然價格相對便宜，但質量良莠不齊，批間差異較大。

要確保抗體的高質量，我們通常是選擇可信賴的品牌，此外，還應注意抗體的供應商渠道是否正規，其供應鏈物流是否專業。綜合這幾方面因素，Sigma-Aldrich都是不錯的選擇。Sigma-Aldrich是國內最早實行電子商務的生命科學產品供應商，並以直銷為主導，避免了中間流通環節的問題，加上其強大的物流體系，很大程度上降低了銷售環節可能帶來的實驗風險。

完善的驗證數據是抗體選擇的必要參考

優質抗體還應具備完善的驗證數據和詳細的信息標註，比如：是否明確標註其可以用於Western Blot、是否有足夠的數據支持證明該抗體適用於某一組織或者樣本、是否有明確的抗體建議稀釋濃度、該抗體的識別位點是連續的胺基酸序列的一級結構還是非連續性胺基酸的三維結構位點……這些信息和數據的真實性及完整性是保證Western Blot實驗順利進行的關鍵。

關於這一點，HPA金標抗體及其所提供的數據是一個很好的案例。HPA抗體資料庫覆蓋了人類85%的蛋白，每支抗體均通過嚴格的抗原序列篩選及親和層析純化流程，確保其特異性和純度。此外，每支抗體在多種組織樣品中經過蛋白晶片、Western Blot、免疫組化、免疫螢光等實驗的驗證，並獲得學術委員會的認證。作為重要的參考數據，所有的實驗驗證、發表文獻和生物信息學預測都公布在proteinatlas.org網站供大家免費查詢。完善的實驗數據支持可避免因信息不完整而造成的選擇錯誤。

有效的內參抗體是實驗準確的重要憑證

在Western Blot中，內參是由持家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，在各組織和細胞中的表達相對恆定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用來做參照物。藉助內參校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差，是證明Western Blot實驗結果真實可靠的重要憑證。一些常見的內參基因及抗體包括β-actin、GAPDH、PCNA、α-Tubulin等。

值得注意的是，不同的內參抗體只適用於一定範圍的樣本和組織，我們需要查閱參考文獻，並根據樣本和組織的差別選擇合適的內參抗體，以確保實驗的準確性。（如下表所示）

在Western Blot中如果抗體選擇或使用不當，可能會造成無信號、弱信號、高背景、有雜帶等實驗問題，下表就此類實驗問題給出案例分析和解決方案，供參考。

以上是關於Western Blot實驗過程中如何選擇合適的、高品質抗體的一些建議，以及由於抗體選擇和使用不當而造成實驗失敗的問題總結，希望能給大家一些幫助和啟發。此外， Western Blot還有很多關鍵的實驗環節需要注意，比如怎樣製備高質量的蛋白樣品、怎樣保護蛋白樣品不被降解、怎樣配製合適的SDS-PAGE凝膠等，在之後的篇章裡會逐步為大家介紹。（生物谷Bioon.com）

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    ，說法各異，於是綜合了目前網上所能找到的資料和個人實際經驗，編輯了這份 western blot 操作步驟，內容包括主要操作步驟和所需要注意的有用的細節，並附上參考文獻。我按下文的步驟操作已經做出來了穩定可重複的、背景乾淨的 western 條帶了，所以相信你也行。為了節省時間，我總結了一下 western blot Quick Guide和一天做出 western 的具體時間規劃，附在文末，要在下一次展示。
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