抗體-二抗的選擇難道真的只有那麼簡單?

二抗：二抗是在其它宿主體內製備的能與一抗或一抗片段結合的抗體，上面通常連有酶或螢光素等標籤。

二抗針對某一特定物種（如小鼠）的所有抗體均具有特異性，因而使用標記的二抗可以免去對每一個一抗進行標記，大大節省了時間和費用；此外，一個一抗分子可以同時結合幾個二抗分子，從而使信號大大增強，提高了實驗靈敏度。

抗體特異性產品整個分子 (H+L) 特異性抗體Affinity Purified Anti-BOVINE IgG (H&L) (GOAT)
Peroxidase Conjugated Anti-BOVINE IgG (H&L) (GOAT)
Fluorescein Conjugated Affinity Purified Anti-BOVINE IgG (H&L) (GOAT)Fab 特異性抗體Peroxidase Conjugated Anti--HORSE IgG F(ab')2 (GOAT)
Fluorescein Conjugated Affinity Purified Anti-CHICKEN IgG F(ab')2 (RABBIT)
Affinity Purified Anti-BOVINE IgG F(ab')2 (GOAT)Fc 或重鏈特異性抗體Affinity Purified Anti-CHICKEN IgM (mu chain) (GOAT)
Cy2 Conjugated Affinity Purified Anti-MOUSE IgG2a (Gamma 2a chain) (RABBIT)
Fluorescein Conjugated Anti-MOUSE IgG (gamma chain) (RABBIT)輕鏈特異性抗體Anti - Kappa Light Chain (B - Cell Marker)
AP Goat anti Rat IgG, Light Chain
Biotin-SP Goat anti Mouse IgG Light chain specific吸附處理的抗體Cy2-IgG Fraction of Monoclonal Mouse Anti-Rabbit IgG, Light Chain Specific (min X Bov, Gt, Arm Hms)
Mouse anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Hu, Gt, Ms, Shp Sr Prot)

Table 1. 典型的整個IgG分子的二抗

如何選擇二抗

通常情況下，某一特定的實驗中可能同時有幾種二抗可供選擇，如何能選擇到最適合該實驗的二抗，需要綜合以下幾個方面進行考慮：

一抗的物種來源

一抗是在什麼物種來源的，相應的二抗也要是抗該物種的抗體。例如，如果一抗是在小鼠體內製備的，那麼你就應當選擇抗小鼠的二抗，如果一抗是在兔體內製備的，那麼二抗就應當是抗兔的抗體。至於二抗本身是在什麼動物中製備的對二抗的質量並無明顯的影響。

一抗是屬於哪個類或亞類

二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應的二抗就是抗IgG抗體。

單克隆抗體的類別及亞類通常會在產品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那麼相應的二抗就應當是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗體。

如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那麼幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結合，或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那麼你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。

如果你不知道一抗是哪一類別或亞類，那麼抗小鼠IgG是一個不錯的選擇，因為此種抗體可以識別大多數類型的IgG免疫球蛋白。

不同特異性的二抗

1.針對整個抗體分子（H＋L）具有特異性：如抗IgG(H+L)

此類抗體既可以與抗體的重鏈結合也可以與輕鏈結合，即與抗體分子的Fc，F(ab』)2/Fab部分均可反應，抗IgG(H+L)也可以與其他免疫球蛋白家族反應（如IgM和IgA），因為所有的免疫球蛋白都具有相同的輕鏈（kappa鏈或lambda鏈）。

2.針對Fab片段具有特異性

這類抗體與重鏈輕鏈均可以結合，由於它們可以與輕鏈反應，它們同時也已和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白反應。

3.對Fc片段或重鏈具有特異性

這類抗體和重鏈的Fc部分反應，它們是類別特異性的（即gamma鏈特異性抗體只與IgG反應，mu鏈特異性抗體只識別IgM，依此類推）。

4.輕鏈（kappa，labmda）特異性

與所有類別的抗體反應，因為所有類別的抗體均具有相同的lambda鏈或kappa鏈。

5.經過吸附處理的二抗

不同來源的免疫球蛋白含有相似的結構，抗一個物種的抗體可能與其他物種發生交叉反應，有些二抗經過了動物或人類IgG吸附處理，以減少非特異性背景。例如，如果是小鼠的組織或細胞，那麼選擇經小鼠血清或IgG吸附處理過的二抗可以減少非特異性結合。但是此種抗體識別表位的數量被大大減少。

F(ab')2 fragment of Anti-RAT IgG (H&L) (RABBIT)Fluorescein Conjugated F(ab')2 fragment of Anti-BOVINE IgG (H&L) (RABBIT)Fluorescein Conjugated F(ab')2 fragment of Anti-GOAT IgG F(ab')2 (RABBIT)Fluorescein Conjugated F(ab')2 fragment of Anti-GOLDEN SYRIAN HAMSTER IgG (H&L) (RABBIT)

Table 2. 典型的F(ab』)2片段的二抗

選擇哪種形式的二抗，是整個IgG分子，F(ab』)2片段，還是Fab片段？

整個IgG分子：此種抗體適用於多數情況。F(ab』)2片段：該種抗體是由兩個靠二硫鍵連接的用於結合抗原的Fab片段組成，這些抗體用在特定的情況中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細胞結合的情況。Fab片段：它們只有一個結合位點，一般用來封閉內源性免疫球蛋白。

一般來講，耦聯到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和鹼性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），螢光基團（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決於具體的實驗。對於western blot和ELISA，最常用的二抗是酶標二抗，而細胞或組織標記實驗（細胞免疫化學，組織免疫化學，流式細胞術）中通常使用螢光基團標記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用biotin/avidin檢測系統。

Fab fragment Goat anti-Rabbit IgG (H+L)Cy3 AffiniPure Fab Fragment Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)Cy2-conjugated AffiniPure Fab fragment rabbit anti-mouse immunoglobulin G (IgG; H+L)

Table 3. 典型的Fab片段的二抗

下面簡單介紹幾種二抗探針的優缺點及其適用的實驗

酶：主要有兩種不同的酶耦聯物，HRP和AP。比較而言，前者更經濟、快速、穩定，而後者較前者更為靈敏，通常情況下，HRP廣泛應用於免疫組化，western blot和ELISA中，而鹼性磷酸酶（AP）更適合於固相的免疫檢測實驗，如ELISA和western blot.

螢光基團：

FITC：FITC是廣泛使用的螢光基團，但其最大的缺點是淬滅快，使用抗淬滅劑可以減輕。

AMCA：常用在多標記實驗中，如免疫螢光、流式細胞術。其缺點是，淬滅快，且由於肉眼不能很好的檢測其所激發的藍色螢光，因而AMCA耦聯的二抗更適用於檢測大量存在的抗原。

花青染料（Cy2,Cy3,Cy5）：Cy2比FITC更穩定，且在表面螢光顯微鏡下，Cy2的螢光FITC更強。Cy3和Cy5比大多數螢光基團更亮，更穩定，背景更弱。二者常在共聚焦顯微實驗中作多標記。但Cy5的缺點是不能用表面螢光顯微鏡觀察，因此通常用具有遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡觀察。

TRITC,RRX,TR:TRITC經常和FITC一起用於雙標記實驗中，也可以使用RRX或TR，但TR會產生較高的背景。在使用裝有氪氫燈的雷射共聚焦掃描顯微鏡作三標記實驗時，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因為RRX的發射波長在Cy2和Cy5中間，且和這兩者的重疊很少。

PE：常和FITC一起用於流式細胞術雙標記實驗。

生物素：生物素（biotin）可以和抗生素蛋白（avidin）發生不可逆反應而緊密結合在一起。首先加入生物素標記的二抗，在加入耦聯有酶或螢光集團的avidin、ExtrAvidin或streptavidin，後者能夠結合於二抗表面的多個位點上，從而極大的放大檢測信號。

抗體的純度：

親和層析純化的抗體一般更受人們歡迎，因為這些產品的純度最高，產生的非特異性背景最少。但是有些情況下也要考慮到純化過程中損失的IgG部分，因為其中含有親和力很高的抗體，尤其是當目的抗原存在的量很小的時候，高親和性的IgG部分就顯得尤為重要。

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