視頻中，主要介紹了蛋白質免疫印跡的主要步驟，即樣品製備，SDS-PAGE，膜阻斷/用抗體探測和檢測。
（視頻+文字一起「食用」更佳哦~）
蛋白質免疫印跡是一種分析技術，用於檢測給定的組織勻漿或提取物樣品中的特定蛋白質。它使用凝膠電泳通過多肽的長度（變性條件）或通過蛋白質的3-D結構（天然/非變性條件）分離天然或變性蛋白質。然後將蛋白質轉移到膜（通常是硝酸纖維素或PVDF），在那裡使用對靶蛋白特異的抗體探測（檢測）它們。
1.樣品製備
蛋白質免疫印跡的第一步是樣品製備。為了製備用於運行凝膠的樣品，需要裂解細胞和組織以釋放目的蛋白質。
CytoBuster或PhosphoSafe是一種方便，易於使用的多功能且易於用於可溶性蛋白質提取的試劑。這些提取緩衝液含有優化用於從哺乳動物和昆蟲細胞中有效提取可溶性蛋白質的洗滌劑。CytoBuster蛋白質提取試劑的溫和，非離子組合物能夠分離功能活躍的內源或表達的蛋白質，而無需二次處理，如超聲處理或冷凍/解凍。PhoshoSafe還含有四種磷酸酶抑制劑。
通過低速離心（例如在2500xg下5分鐘）沉澱細胞，將細胞沉澱物充分排出。
使用150μL/ 10 6個細胞重懸CytoBuster蛋白質提取試劑中的細胞（最佳量的CytoBuster蛋白質提取試劑可根據細胞大小而變化）。
在室溫下孵育5分鐘。
轉移到合適的管中，在4℃下以16,000×g旋轉5分鐘。
將澄清的上清液（細胞提取物）轉移到新管中並進行分析。
對於專門的蛋白質提取，我們建議使用我們的高品質ProteoExtract Kits。EMD有十幾種用於線粒體分離，亞細胞蛋白質組提取，跨膜蛋白提取和其他許多試劑盒的試劑盒。請訪問我們的Western blot登陸頁面了解更多詳情。
EMD還銷售各種蛋白酶和磷酸酶抑制劑雞尾酒套裝。一旦發生裂解，就開始蛋白水解，去磷酸化和變性。如果將樣品一直保持在冰上或4℃下，並且將新鮮的適當抑制劑添加到裂解緩衝液中，則這些事件可以極大地減慢。請訪問我們的Western blot登陸頁面了解更多詳情。
2. SDS-PAGE
蛋白質免疫印跡的第二步是蛋白質分離。蛋白質基於分子量分離。
您可以製作自己的PAGE凝膠，但我們將使用商業預製凝膠。
準備好樣品後，您就可以確定蛋白質濃度了。EMD有兩個用於測量濃度的試劑盒，一個是非幹擾蛋白質分析試劑盒，另一個是BCA蛋白質分析試劑盒。
一旦評估了蛋白質濃度，我們就可以準備好我們的樣品來加載凝膠。抗體通常識別感興趣的蛋白質的一小部分（稱為表位），並且該結構域可以存在於蛋白質的3D構象內。為了使抗體能夠進入該部分，必須展開蛋白質。
為了變性，使用含有陰離子變性洗滌劑十二烷基硫酸鈉（SDS）的上樣緩衝液，並將混合物在95-100℃下煮沸5分鐘。一個簡單方便的加載緩衝區是4X Sample Buffer。
使用Trail Mix Protein Marker加載孔的第一道。該標記具有三個參考條帶，可用於監測電泳。當凝膠被染色時，可見10個條帶，範圍為10-225kDa。
用運行緩衝液填充電泳裝置。對於PAGE凝膠，這通常是1X Tris-甘氨酸。有關詳細的緩衝液配方，請訪問Western blotting頁面。EMD通過我們的OmniPur化學品系列提供高質量的緩衝試劑。在220V下運行凝膠1小時。
蛋白質分離後，用考馬斯藍染色凝膠，確保蛋白質均勻均勻地遷移。RAPIDstain是一種易於使用的超敏感染色劑。不需要脫色。
3.蛋白質轉移
正如帶電荷的蛋白質可以被誘導通過電場中的凝膠一樣，蛋白質也可以在電場中從凝膠轉移到膜上，即PVDF或硝酸纖維素膜。
首先進行溼轉移。在溼轉移中，凝膠和膜夾在海綿和紙之間（海綿/紙/凝膠/膜/紙/海綿），並且在確保凝膠和膜之間沒有形成氣泡之後將它們緊緊地夾在一起。將夾層浸入轉移緩衝液中，施加電場。帶負電荷的蛋白質朝向帶正電的電極傳播，但是膜阻止它們，將它們結合，並防止它們繼續存在。
有兩種類型的膜：硝化纖維素和PVDF。兩者都運作良好。今天我們將使用PVDF。PVDF膜需要在甲醇中浸泡幾分鐘，然後用冰冷的轉移緩衝液浸泡5分鐘。凝膠還需要在冰冷的轉移緩衝液中平衡幾分鐘。不這樣做可能會在轉移過程中縮小凝膠。
用於溼轉移的緩衝液是1X Tris-甘氨酸和20％甲醇。我們的網站上提供了詳細的緩衝液製備。
一旦轉移完成，最好是可視化蛋白質，以確保均勻轉移，沒有氣穴。這可以通過RedAlert Western Blot Stain輕鬆完成。這種汙漬即可使用，並且可以用水輕鬆完成脫色。
4.抗體和輔助試劑
進行探測和抗原抗體的第一步是阻斷膜。阻斷膜可防止非特異性背景結合。
無脂牛奶或BSA均可用作封閉溶液。但是，使用磷酸特異性抗體時，不建議使用牛奶，因為它會導致高背景。
EMD提供了幾種高質量的封閉試劑，包括非哺乳動物封閉劑SeaBlock和BLOT QuickBlocker，它是即用型封閉劑。我們還提供高質量的BSA（Fraction V）。
在溫和攪拌下將膜在室溫下孵育1小時。
孵育後在TBST或PBST中洗滌三次。製作TBST或PBST的簡便方法是使用我們的平板電腦（PBS TWEEN平板電腦/ TBS TWEEN平板電腦）
一旦膜被阻斷，您就可以與第一抗體一起孵育。30多年來，EMD一直提供全面的抗體保證產品組合，具有業內最佳的抗體保證。請記住，對於所有EMD抗體，我們提供完全100％無風險保證。購買抗體並將其用於您想要的任何物種特異性或應用。如果抗體不能令您滿意，我們將提供用於任何其他產品的完整信用。有關詳細信息，請訪問我們的Western blotting網頁。
使用SignalBoost的解決方案1孵育我們的一抗。SignalBoost是一款出色的產品，可以顯著增強您的信號。只需在溶液1中孵育您的第一抗體，然後像往常一樣孵育1小時。無需添加其他阻斷劑。或者，您可以使用BSA或脫脂奶粉作為阻斷劑。
用TBST清洗。我們使用即用型TBST片劑製作TBST。
使用SignalBoost溶液2孵育您的二抗。將第二抗體在封閉緩衝液中孵育1小時。用TBST再次洗滌膜數次。
5.檢測
對於HRP綴合二抗，傳統上使用ECL。視頻裡提供的ECL試劑是RapidStep。RapidStep的優點是不需要混合管腔或增強劑。只需將膜噴塗幾次，然後使用X光膠片進行顯影。RapidStep提供低象形圖靈敏度，並在添加基材後長達2小時發光。
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