蛋白質印跡實驗具體操作步驟

2020-11-28 儀器信息網

蛋白質印跡實驗具體操作步驟

   蛋白質印跡免疫分析的過程包括蛋白質經凝膠電泳分離後，在電場作用下將凝膠上的蛋白質條帶轉移到硝酸纖維素膜上，經封閉後再用抗待檢蛋白質的抗體 作為探針與之結合，經洗滌後，再將濾膜與二級試劑-放射性標記的或辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶 偶聯抗免疫球蛋白抗體 結合，進一步洗滌後，通過放射自顯影或原位酶反應來確定抗原-抗體-抗抗體複合物在濾膜上的位置和豐度。

    【蛋白質印跡實驗所需試劑】

    1.IgG 標準品

    2.羊抗人辣根過氧化物酶（HRP）標記的IgG 抗體

    3.轉移buffer:Tris 3.03g,Gly14.4g,甲醇200ml,加三蒸水至 1000ml充分溶解，4℃冰箱貯存。

    4.Tris buffer（TBS）：Tris 2.42g,NaCl 29.2g,溶於600ml三蒸水，再用1N HCl調至pH7.5,然後補加三蒸水至1000ml.

    5.漂洗液（TTBS）：TBS液500ml,加 Tween20 250ul.

    6.封閉液：5%脫脂奶粉。

    7.抗體buffer:1.5g BSA溶於50ml TTBS.

    8.顯色液DAB（3.3-diaminobenzidine,3.3-二氨基聯苯胺）配製：5mg DAB溶於10ml 檸檬酸buffer（0.01mol/L 檸檬酸2.6ml,0.02 mol/L Na2HPO4 17.39ml），加30% H2O2 10

    μl（臨用時現配）。

    9.脫色液：甲醇250ml,冰醋酸100ml,加蒸餾 水至1000ml.

    10.氨基黑染色液（0.1%氨基黑 -10B）：0.2g 氨基黑-10B 溶於200ml 脫色液中，充分攪拌溶解，濾紙 過濾。

    【蛋白質印跡實驗操作步驟】

    一、樣品的SDS -聚丙烯醯胺凝膠電泳

    按實驗四操作步驟進行。加樣時，注意在同一塊膠上按順序做一份重複點樣，以備電泳結束時，一份用於免疫鑑定，一份用於蛋白染色顯帶，以利相互對比，分析實驗結果。

    二、轉移印跡

    1.轉移前準備：將濾紙，硝酸纖維素膜（NC）剪成與膠同樣大小，NC膜浸入蒸餾 水中 10-20min 後浸入轉移buffer中平衡30min .

    2.凝膠平衡：將電泳後的SDS -PAGE膠板置於轉移buffer 中平衡 30-60min.

    3.按圖操作：逐層鋪平，各層之間勿留有氣泡和皺摺。

    4.開始轉移，連接正負極，蓋好蓋子，接上電源，恆流 0.8mA/cm,室溫下轉移1h,轉移後的凝膠再用氨基黑10B染色液染色20min ,然後脫色檢測轉移效果。

    三、免疫染色

    1.轉移後的NC膜於5%脫脂奶粉中封閉，4℃過夜。

    2.TBS洗膜1-2次，10min/次。

    3.加HRP標記的抗體，室溫1h .

    4.TBS 洗3次，10min/次。

    5.NC膜再轉入DAB顯色液中，置暗處反應，待顯色反應達到最佳程度時，立即用三蒸水洗滌終止反應。


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