免疫螢光技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。它是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上螢光基團，再用這種螢光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。利用螢光顯微鏡可以看見螢光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及利用定量技術（比如流式細胞儀）測定含量。
一、免疫螢光原理簡介
免疫螢光實驗的主要步驟包括細胞片製備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及螢光檢測等。細胞片製備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫螢光實驗的第一步，細胞片的質量對實驗的成敗至關重要，原因很簡單，如果發生細胞掉片，一切都無從談起。這一步關鍵的是玻片（Slides or Coverslips）的處理以及細胞的活力，有人根據成功經驗總結出許多有益的細節或小竅門，非常值得借鑑。固定和通透步驟最重要的是根據所研究抗原的性質選擇適當的固定方法，合適的固定劑和固定程序對於獲得好的實驗結果是非常重要的。免疫螢光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類似的，最重要的區別在於免疫螢光實驗中要用到螢光抗體，因此必須謹記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關鍵。最後需要注意的是，標記好螢光的細胞片應儘早觀察，或者用封片劑封片後在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或螢光減弱而影響實驗結果。
由於操作步驟比較多，同時在分析結果時無法像WB那樣可以根據分子量的大小區分非特異性識別，所以要得到一個完美的免疫螢光實驗結果，除了需要高質量的抗體，以及對實驗條件進行反覆優化外，還必須設立嚴謹的實驗對照。總之，免疫螢光實驗從細胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最後的封片及觀察拍照，每步都非常關鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個步驟的質量，才能最終達到你的實驗目的。
二、基本實驗步驟
（1） 細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成單層後取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機製備細胞片或直接製備細胞塗片。
（2） 固定。根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢後的細胞可置於含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.
（3） 通透。使用交聯劑（如多聚甲醛）固定後的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。通透的時間一般在5-15min.通透後用PBS洗滌3×5 min.
（4） 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.
（5） 一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次衝洗5min.
（6） 二抗結合。間接免疫螢光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次衝洗5min後，再用蒸餾水漂洗一次。
（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，螢光顯微鏡檢查。
（一）細胞準備
用於免疫螢光實驗的細胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經過離心後塗片的懸浮細胞或者是將取自體內的組織細胞懸液離心後塗片。貼壁良好的細胞一般在培養時直接放入coverslips讓細胞生長在其上即可，儘量避免使用貼壁性能不好的細胞進行免疫螢光實驗，以免後續的漂洗操作引起細胞脫落。少數實驗需要使用這類細胞或者懸浮細胞進行免疫螢光觀察，建議使用細胞離心甩片機製備細胞片或直接製備細胞塗片。
（二）固定和通透
除研究細胞表面抗原或不穩定抗原可不固定外，一般均應固定。固定的目的有三：
①防止細胞從玻片上脫落；
②除去防礙抗原-抗體結合的類脂；
③使標本易於保存。
標本的固定原則是：
①不能損傷細胞內的抗原；
②不能凝集蛋白質；
③應保持細胞和亞細胞結構；
④固定後應保持通透性，以保證抗體自由進入所有細胞與亞細胞組分與抗原結合。
常用的固定劑有多種，應根據所研究抗原的性質和所使用的抗體特性選擇適當的固定劑。通常固定方法可以分為兩類：有機溶劑和交聯劑。有機溶劑如甲醇和丙酮等可去除類脂並使細胞脫水，同時將細胞結構蛋白沉澱。交聯劑如多聚甲醛通常通過自由胺基酸基團形成分子間橋連，從而產生一種抗原相互連接的網絡結構。交聯劑比有機溶劑更易於保持細胞的結構，但因為交聯阻礙抗體結合，可能會降低一些細胞組分的抗原性，因此需要增加一個通透步驟以使抗體能夠進入標本。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白作為抗原生產的抗體在免疫螢光中可能更為有效。
最常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇，少數情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進行固定。通常，細胞結構抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙醇及高濃度的甲醛固定可獲得較好的結果，而細胞膜相關組分抗原一般以多聚甲醛固定。細胞器和細胞顆粒內的抗原一般也用多聚甲醛固定，並需要進行通透以使抗體能達到抗原表位。
通透步驟只在檢測細胞內抗原表位的時候才需要，因為抗體需要進入細胞內部去檢測蛋白。但是，如果待檢測的是跨膜蛋白，且其抗原表位處於胞質內區域，則同樣需要對細胞進行通透。相反，如果所檢測的抗原表位位於膜蛋白的胞外段，則不需要進行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作為固定劑時是不需要通透的。甲醇同樣具有通透作用，但有些場合併不適合用甲醇，因為一些表位對甲醇非常敏感。常用的通透劑是去垢劑，如Triton ,NP-40,以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40屬於烈性去垢劑，可部分溶解細胞核膜，因此非常適合核抗原檢測。但應該注意的是，如果在高濃度下使用或者作用時間過長，它們將破壞蛋白，從而影響實驗結果。Triton X-100是最常用的通透劑，但是它將破壞細胞膜，因此不適用於細胞膜相關抗原。後面一組去垢劑要溫和得多，它們可以在細胞質膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過，但是不會溶解細胞質膜。適於胞質抗原或者質膜上靠近胞質一面的抗原，也適於可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定後通透，但針對有些水不溶性的目的抗原的檢測宜先通透再固定，這樣做的原因主要是可以通過通透去除許多水溶性的蛋白，從而大大減少了免疫螢光的背景和非特異性信號。固定後以冷PBS液漂洗，最後以蒸餾水衝洗，防止自發性螢光。
（三）封閉
封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結合，最常用的封閉劑為1% BSA, PBS pH 7.5,其他可選擇的封閉劑還有 1% gelatin, 1%bovine 或與二抗種屬相同的血清（3-10%）等。
（四）抗體孵育
直接免疫螢光法中的一抗和間接免疫螢光法中的二抗都是螢光抗體，因此在這些抗體孵育的時候必須注意避光。此外，為保證結合質量和防止乾燥，抗體孵育應儘量在溼盒中進行。
（五）封片及螢光觀察
標記好螢光的細胞片原則上可以直接進行觀察，特別是有時候封片不當反而使得前功盡棄。但在絕大多數情況下，為了保存結果，以便進一步觀察、照像、統計分析等，需作封片處理。常規的方法是採用甘油或中性樹脂封片，為了增強封片的效果，往往需要在封片時添加特殊的抗螢光淬滅劑。
（六）標本保存
由於螢光色素和蛋白質分子的穩定性都是相對的，因此隨著保存時間的延長，在各種條件影響下，標記蛋白可能變性解離，失去其應有的亮度和特異性。因此給標本的保存帶來一定的困難，所以在標本進行螢光染色之後應立即觀察。由於性能良好的抗螢光淬滅劑的出現，螢光標記的標本可以在低溫（4℃或-20℃）下保存相當長的時間。在某些情形下，考慮到實驗的成本及實驗條件，也可以採取權宜的辦法，比如固定標本片後低溫保存，在需要時再進行螢光標記，即隨用隨染。