免疫螢光技術的實驗方法及其分類

　　一、免疫標記法及其分類

　　1.螢光免疫法

　　原理是應用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產物發出的螢光，螢光強度與Mb濃度呈正比，可在8min內得出結果。結果以Mb每小時釋放的速率表示（△Mb）表示。該法重複性好，線性範圍寬，具有快速、敏感、準確的特點。

　　以雙抗夾心法為例，首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。除去未結合抗體，然後加受檢標本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體複合物。洗滌除去未結合物，接著加入螢光標記的抗體，使之與抗原特異性結合，形成抗體—抗原—抗體複合物。最後根據螢光強度，即可對蛋白抗原進行定量。

　　傳統的螢光免疫法受本底螢光的幹擾較大，時間分辨螢光免疫測定法是以具有特長壽命的稀土金屬如銪，作為標記物，加入正常液後激發測定，能有效去除短壽命本底螢光的幹擾。

　　2.放射免疫法

　　放射免疫法是以過量的未標記抗原與放射性物質標記的抗原，競爭性地與抗體結合，形成有放射性的抗原—抗體複合物與無放射性的抗原—抗體複合物，並有過剩的標記抗原與未標記的抗原。然後通過離心沉澱等方法，將抗原—抗體複合物與游離抗原分離，分別測定其放射性強度與標準曲線比較，即可對未標記的待測抗原進行定量。

　　RIA法測定血清蛋白靈敏度高、特異性強，可準確定量到ng／ml水平。但早期的方法操作麻煩，耗時長，且有放射性汙染。近年來，隨著單克隆抗體的應用，RIA的靈敏度又有了較大提高，且操作大為簡化，並已有商品試劑盒供應，使用方便。

　　3.酶聯免疫法（ELISA）

　　ELISA法有競爭法和夾心法兩種。競爭法是基於標準或血清Mb和微孑L板上包被的Mb競爭性地與單克隆抗體相結合的原理而建立，該法的最低檢測限為10μg／L，線性範圍達1 000ug／L。夾心ELISA法與EIA具有良好的相關性（r＝0.92）。ELISA法具有靈敏度高，特異性強，精密度好，操作簡單，適用於多份標本的檢測，不需特殊儀器設備等優點，易於推廣普及。但不適合急診的快速檢測。

　　以雙抗法為例。首先包被抗原，然後加入一抗，使一抗與包被抗原形成抗原—抗體複合物。接著加入酶標二抗，形成抗原—抗體—抗體複合物。最後加入底物，由酶催化底物生成產物。通過產物的生成量即可對蛋白抗原進行定量。

　　4.偶聯生物素—親和素系統的酶免法

　　利用了一個親和素分子可以與4個生物素分子結合的特性，使傳統的靈敏度較高的酶免法的靈敏度又有明顯的放大作用。

　　5.時間分辨螢光免疫分析

　　時間分辨螢光免疫分析（Time resolved Fluor immunoassay，TRFIA）是一種非同位素免疫分析技術，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發光特點，用時間分辨技術測量螢光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非特異螢光的幹擾，極大地提高了分析靈敏度。

　　6.解離增強鑭系元素螢光免疫分析

　　解離增強鑭系元素螢光免疫分析（Dissociation Enhanced Lanthanide Fluor immunoassay DELFIA）是時間分辨螢光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團結構的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標記的抗體/抗原，經過免疫反應之後生成免疫複合物。由於這種複合物在水中的螢光強度非常弱，因此加入一種增強劑，使Eu3 從複合物上解離下來，自由Eu3 同增強劑中的另一種螯合劑螯合形成一種膠態分子團，這種分子團在紫外光的激發下能發出很強的螢光，信號增強了百萬倍。因為這種分析方法使用了解離增強步驟，因此稱為解離增強鑭系元素螢光免疫分析。