貼壁細胞免疫螢光染色

2020-12-04 biomedical718

免疫螢光染色實驗是細胞生物學中檢測蛋白表達的常見方法，如何做好免疫螢光染色實驗尤為重要。

1. 細胞爬片

免疫螢光實驗用到的原理是抗原與抗體特異性結合。因此為了便於操作，通常將細胞接種在蓋玻片上。而細胞很難在蓋玻片上生長，所以在開始實驗前要將蓋玻片以多聚賴氨酸包被。將蓋玻片浸泡在消毒酒精中過夜，鑷子夾取一片蓋玻片並在酒精燈旁烘乾，待其冷卻後放入六孔板。以免溫度過高導致六孔板底部融化。加入多聚賴氨酸溶液，以覆蓋蓋玻片為準，避光孵育30分鐘以上，然後吸去液體，風乾以備用。

進行細胞接種前，要算好要接種細胞的量，一般對於觀察單個細胞的蛋白表達，細胞數要少，以保證在高倍鏡下沒有其他細胞幹擾。細胞接種在後進行相應染色前細胞預處理。

2. 免疫染色

細胞在進行免疫螢光染色前需要對細胞進行多聚甲醛固定以及細胞膜通透化處理，這裡主要是用Triton X-100破膜劑。細胞進行通透化處理後，還要用牛血清白蛋白BSA封閉20分鐘。然後就可以進行一抗孵育了，一般一抗孵育不需要避光，室溫下孵育2小時或者4度冰箱孵育過夜。如果是把抗體直接遞到蓋玻片上，這樣會造成抗體試劑的浪費，我們可以找個舊的載玻片，並在上面貼上寬度大於蓋玻片的封口膜。然後把稀釋好的抗體滴在封口膜上，這樣的話每張片子只需要10-20微升稀釋後的抗體。當然了，在放蓋玻片時要看清正反面，細胞面朝向封口膜。按照同樣的操作步驟進行二抗孵育，此時就要避光了。最後還需要然細胞核，可以用DAPI或Hoechst 33258染料染色，方法跟一抗二抗孵育方式類似。

染色結束後，要進行封片保存，同時也要滴加抗螢光衰減劑。蓋玻片的邊緣可用指甲油塗抹，但是要注意保持通風。自然風乾後就可以在顯微鏡下觀察了。

免疫螢光染色細胞黏著斑（paxillin）

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