簡介
體外監測細胞的增殖對於基礎研究和應用研究都極有價值並有潛力應用在臨床領域。 3H-thymidine 或 5-bromo-deoxyuridine (BrdU, 胸苷的類似物 ) 摻入法是確定培養細胞的增值率的傳統方法，這主要是因為幾乎沒有更方便的替代方法。因而人們投入了大量的精力來開發一種快速、可重複的用來檢測細胞分裂的方法，多數研究最終集中在使用螢光化合物上。然而，現在還沒有能夠在細胞分裂過程中特異的摻入細胞，並能直接在單細胞水平上檢測到的螢光物質。
藉助流式細胞儀利用螢光標記的抗 BrdU 的抗體來檢測在 DNA 合成過程中摻入的 BrdU 的方法可以間接檢測快速增值的細胞。 Hoechst 染料也可被用於檢測 BrdU 的摻入，因為 BrdU 摻入的地方其螢光信號被淬滅。這種方法也可被用於細胞增值的研究，特別是細胞循環分析中。然而另一種基於 BrdU 的利用螢光監測細胞增殖的方法是通過光裂解法的鏈斷裂誘導。在這個例子中，新合成的 DNA 中摻入了 BrdU 的細胞在 UV 光裂解誘導 DNA 鏈斷裂後被 Hoechst 33258 染色。用 ChromaTide BODIPY-FL-14-dUTP 作為一種末端脫氧核苷酸轉移酶的底物使用一步法可以檢測這些斷裂。雖然這些方法在檢測細胞增殖中相當有用，但他們可能在監測細胞凋亡中更具吸引力。 Molecular Probes Inc. 公司開發了一種用於測量細胞核酸含量的試劑盒 CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit ，這種檢測方法比以前描述的精確評估體外細胞增殖的方法具有更多的優點。我們開發了在 Genios Plus 利用特別設計的細胞增殖軟體採用 CyQUANT Cell Proliferation Assay 檢測法的微孔板檢測系統。通過這種應用我們希望能夠展示這一系統已能夠用於貼壁細胞和懸浮細胞的增值測定，特別是同時進行大量樣品分析時更具優勢。
這種檢測方法的特點
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit 試劑盒使這種利用微孔板螢光檢測儀的螢光檢測法更加方便。這種檢測法特別設計用來快速、定量的篩選影響體外不同類型細胞增殖的因子。 R. Haugland 在"螢光探針與研究化合物手冊"（ Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals ； edition VI, Molecular Probes, Inc. ）中描述了這種檢測方法的細節和優點。然而，當使用 CyQUANT assay 檢測法時應該考慮兩點。第一，與基於 BrdU 的檢測方法不同的是， CyQUANT 檢測法並不區分處於增殖期的細胞和處於 S 期的休眠細胞。其次，這種檢測方法並不能區分增殖後的細胞群中的健康細胞和受損細胞。這在某些環境下是不方便的。特別是當篩選同時影響細胞凋亡的抑制增殖的因子時。事實上，不能確定並發凋亡的程度可以導致對所測試的因子的抑制效果作過低或過高的估計。很明顯後一個問題僅發生在貼壁細胞中，脫離的死細胞會在檢測的各步中從板中洗去。此外，在這個例子中，如果 CyQUANT assay 檢測法中結合使用合適的螢光素在 Genios Plus 螢光檢測儀中 對所檢測的活細胞染色可以儘量的避免這一問題。
檢測步驟
附件
• CyQUANT 細胞增殖檢測試劑盒（ CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit ， Molecular Probes, Inc.)
• 微孔板螢光檢測儀 ( SPECTRAFLUOR Plus , TECAN)
• 細胞生長 / 增值軟體
用平滑肌瘤細胞系 MES-SA 和 SKUT-1 作為貼壁細胞模型，用淋巴瘤細胞系 Jurkat 和 Nalm-6 作為懸浮細胞模型。 Molecular Probes, Inc. 簡要的給出了實驗的方法， MES-SA 和 SKUT-1 細胞在無血清的培養基中過夜培養。然後接種在 96 孔板中（ 5000 個細胞 / 孔）， 96 孔板分別用不同的含有或不含 10% FCS 的細胞外基質 Vitronectin, Fibronectin, 和 I 型、 VI 型膠原蛋白中包埋 9, 27,54 小時。在每個時間間隔輕輕的移去懸浮物，將含有結合細胞的培養板冷凍並保存於 -70°C 等待檢測。
檢測時，培養板在室溫解凍，在避光條件下在每孔中加入 200 m L 的 CYQUANT GR dye/cell lysis buffer, 然後輕輕混合 , 室溫孵育 2-5 分鐘。在使用裝有基於 Excel 的細胞增殖軟體的 Genios Plus ( 激發光 485 nm, 發射光 535 nm) 中讀板。分別對每一種細胞系使用已知濃度的 CyQUANT 處理的細胞製作標準曲線。為了分析假定的激活因子的細胞表面結合影響下的 Jurkat 和 Nalm-6 細胞的增殖， 細胞相似的首先在無血清的培養基中生長，然後被平分到未包埋的 96 孔板中。加入不同濃度的抗未知的細胞表面抗原的單克隆抗體，按如上所述的在 48 小時和 72 小時監測細胞。在接下來的 CyQUANT assay 檢測中的步驟和上面描述的貼壁細胞相同，除了在冷凍之前培養板在 37° C 以 150 x g 離心 5 分鐘。實驗結果如下圖所示：
結果
上兩幅圖 表明不同細胞外基質對生長在含有或不含胎牛血清的兩種平滑肌肉瘤細胞的時間依賴的影響
下兩幅圖： 表明給定時期內生長在含有或不含血清並含有抗體的培養基中淋巴瘤細胞增殖中單克隆抗體對細胞表面的激活抗原的刺激或抑制作用
結論
這篇應用文章描述了使用螢光微孔板技術監測細胞增殖的應用實例。當前用來評價培養細胞增值率的最可靠、最靈敏的方法是使用 Hoechst, DAPI, Propidium iodide 和類似的染料進行核染色。 Molecular Probes 開發了基於螢光的細胞增殖檢測試劑盒（商品名為 CyQUANT ），該試劑盒已被證明在流式細胞檢測和微孔板檢測中很有用。我們在此表明如果聯合使用 Genios Plus 微孔板檢測儀和 同時設計的細胞增殖軟體，這種檢測方法將提供一種高靈敏度的體外檢測貼壁細胞和懸浮細胞增值率的方法。這裡列出的方法對於大量檢測影響這一細胞過程的因素極有價值。