教授SCI經驗傳授：打死也要掌握的6種細胞實驗與方法描述

如果你還處於實驗剛入門階段，細胞實驗就是必學技能，很多小夥伴對於這一塊的知識點都是「知其然而不知其所以然」，一知半解肯定是對以後的實驗研究有非常大的影響，所以今天本著授人以魚不如原則，詳細解說每一個知識點，讓大家完全get！

內容有點長，方便大家保存學習做成了課件，有需要可以文末自行領取

細胞功能分類

6種常見細胞實驗原理

一、細胞增殖

1. 細胞增殖的定義

細胞以分裂的方式進行增殖。單細胞生物，以細胞分裂的方式產生新的個體。多細胞生物，以細胞分裂的方式產生新的細 胞，用來補充體內衰老或死亡的細胞。

2. 細胞增殖的檢測方法

① 細胞代謝活性檢測

（基於MTT、CCK-8等）

MTT（噻唑藍）：通過添加四咪唑鹽到細胞中可進行線粒體內酶代謝活性的測定。活細胞能將四咪唑鹽（如MTT、XTT、WST-1）還原成藍紫色的甲瓚或甲瓚鹽（Formazan），可通過分光光度計或酶標儀進行檢測。

Cell Counting Kit–8 （CCK-8）中的WST-8被細胞內脫氫酶生物還原後生成的橙色甲臢染料能夠溶解在組織培養 基中，生成的甲臢量與活細胞數量成正比。基於CCK-8（WST-8）的試劑盒能高度準確地檢測細胞增殖，比MTT法 及XTT法的靈敏度高5倍，能檢測更低的細胞數目。該試劑盒可適用於96孔板培養的貼壁或懸浮細胞。

② DNA的合成的檢測

（基於BrdU的免疫法或EdU的點擊化學法），可通過體內成像、微孔板或流式細胞術檢測 等多種技術進行細胞示蹤。

DNA的新組裝合成是細胞生長的必要條件，故經常被用來進行細胞增殖、細胞活力及凋亡的檢測。BrdU及EdU，都是胸腺嘧啶的非放射性類似物，能摻入增殖細胞的DNA中，可通過對BrdU及EdU的檢測，從而對DNA的合 成量進行測定。

EdU（5-Ethynyl-2』- deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲 入正在複製的DNA分子中，通過基於EdU與Apollo®螢光染料的特異性反應快速檢測細胞DNA複製活性，適用於細 胞增殖、細胞分化、生長與發育、DNA修復、病毒複製、細胞標記示蹤等方面的研究，尤其適合進行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實驗。

二、細胞凋亡(apoptosis)

1. 細胞凋亡（apoptosis）的定義

細胞凋亡指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。

特點：細胞皺縮、體積縮小；部分細胞器、核糖體和核碎片被細胞膜包裹形成 凋亡小體，從細胞表面出芽脫 落，最後被具有吞噬功能的細胞吞噬；磷脂醯絲 氨酸外翻；細胞核染色質濃縮、邊緣化、染色質DNA斷裂。

2. 細胞凋亡的檢測方法

包括：Caspase活性檢測；DNA片段化分析和檢測；流式細胞術檢測；膜變化檢測（AnnexinV染色、膜 電位、線粒體功能完整性分析檢測實驗）及細胞形態學檢測。

① Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡

細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介於正常細胞與壞死細胞之間。利用這一特點，被檢測細胞懸液 用螢光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞螢光強度來區分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。

Annexin V可與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）能夠透過凋亡中晚期的細胞和死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配 使用，就可以將處於不同凋亡時期的細胞區分開來。

② 細胞形態學檢測-螢光染色法（Hoechst/DAPI）

細胞形態的變化如胞膜皺摺或出泡、核染色質緻密、胞質濃縮等，都可作為細胞凋亡的證據。一般以細胞核染色質的形 態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。DNA 特異性染料有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三種染料與 DNA 的結合都是非嵌入式的，主要結合在 DNA 的 A-T 鹼基區。紫外光激發時發射明亮的藍色螢光。

結果評判

Ⅰ 期：細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased）， 部分染色質出現濃縮狀態；

Ⅱa 期：細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；

Ⅱb 期：的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體

③ TUNEL（原位缺口末端標記技術（in situ end labelling technique,ISEL)）

細胞凋亡中，染色體DNA雙鏈/單鏈斷裂二產生大量的粘性3『-OH末端，在細胞（或組織）結構保持不變的情況下，用熒 光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT)相反應與凋亡細 胞裂解後3『-OH端結合，經顯色反應（細胞染成棕黃色）後檢測DNA裂解點的技術。

三、細胞自噬（Autophagy）

1.細胞自噬的定義

自噬（Autophagy）是普遍存在於真核細胞中的一種高度保守的代謝過程，是細胞內的一種「自食（Self-eating）」現象。它作為細胞內的主要降解途徑，將胞內物質運輸到溶酶體內降解。

它主要有三 種形式：大自噬，小自噬和分子伴侶介導的自噬。

2、細胞自噬檢測方法

① 自噬標誌物（ LC3）檢測

自噬形成時，胞漿型 LC3（即 LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉變為（自噬體）膜型（即 LC3-II），LC3-II/I 比值的大小可 估計自噬水平的高低。LC3 這一轉變過程可被 Western Blot 和螢光顯微鏡檢測到，現已成為監測自噬體形成的推薦方法。在哺 乳動物中，LC3 包含 3 種亞型：LC3A、LC3B、LC3C，分布在不同的組織中，因此需要用不同的抗體去鑑定這3種亞型。

② GFP-LC3 單螢光自噬指示體系

利用 LC3 在自噬形成過程中發生聚集的現象構建了 GFP-LC3 指示體系，無自噬時，GFP-LC3 融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成 時，GFP-LC3 融合蛋白轉位至自噬體膜，在螢光顯微鏡下形成多個明亮的綠色螢光斑點，一個斑點相當於一個自噬體，可以通 過計數來評價自噬活性的高低。

③ mRFP-GFP-LC3 雙螢光自噬指示體系

mRFP-GFP-LC3 融合蛋白的病毒產品 mRFP 用於標記及追蹤 LC3，GFP 的減弱可指示溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體。 由於 GFP 螢光蛋白對酸性敏感(pH 敏感)，當自噬體與溶酶體融合後 GFP 螢光發生淬滅,而 mRFP 相對穩定，因此只能檢測到紅色螢光。

要點：細胞凋亡、自噬和壞死的區別

凋亡：細胞皺縮、體積縮小；部分細胞器、核糖體和核碎片被細胞膜包裹形成 凋亡小體，從細胞表面出芽脫落，最 後被具有吞噬功能的細胞吞噬；磷脂醯絲 氨酸外翻；細胞核染色質濃縮、邊緣化、染色質DNA斷裂。

自噬：部分細胞器腫大，在細胞質中形成包裹細胞質內容物的雙層膜囊泡結構 ，再與溶酶體結合實現內容物的降解。

壞死：細胞脹大，胞膜破裂，細胞內容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分 ，引起局部嚴重的炎症。

四、細胞衰老（cell aging）

1. 細胞衰老的定義

細胞衰老是細胞周期調控下多基因參與的複雜的生理病理過程，是一種抑癌機制，也是生物衰老的潛在原 因之一.細胞衰老最顯著的特徵是細胞在很長一段時間內仍然維持代謝活性，但因阻滯於G1期，失去了對有絲 分裂原的反應能力和合成DNA的能力，不能進入S期.衰老細胞有著顯著的特性，衰老細胞細胞通常體積變大， 表達pH 6.0時有高酶活性的β-半乳糖苷酶。

2.細胞衰老的檢測方法

① β-半乳糖苷酶試劑盒檢測

SA-β-gal試劑盒檢測細胞衰老。以X-Gal為底物，通過細胞內SA β-gal在酸性條件下穩定表達，催化底物生成藍色 產物，表達SA-β-gal的細胞為陽性細胞，呈現藍色，從而在光學顯微鏡下觀察顏色變化以分析細胞的衰老狀況。 僅對衰老細胞進行染色，不會染色衰老前的細胞（presenescent cells）、靜止期細胞（quiescent cells）、永生 細胞（immortal cells）或腫瘤細胞。

② western blot與qPCR檢測衰老相關基因(P16、P21、P53、SIRT1、PCNA)表達。

③ 流式細胞術（PI染色）檢測細胞周期變化

細胞周期（cell cycle)：指細胞從前一次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動過程，通常由G0/G1期、S 期、G2期和M期組成。衰老的細胞阻滯於G1期，失去了對有絲分裂原的反應能力和合成DNA的能力，不能進入S 期。

PI為插入性核酸螢光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的鹼基之間與之結合，其結合的量與 DNA的含量成正比例關係，用流式細胞儀進行分析，就可以得到細胞周期各個階段的DNA分布狀態，從而計算出 各個期的百分含量。

流式細胞周期結果圖解讀

五、細胞遷移和侵襲

1. 細胞遷移和侵襲的定義

①侵襲：腫瘤細胞向器官表面靠攏→腫瘤細胞用偽足貼在表面與內皮細胞粘連→腫瘤細胞用偽足從細胞的天然間隙 到達基底層→腫瘤細胞深入器官深部→形成癌巢搜索

②轉移：腫瘤細胞離開原發瘤，侵入淋巴管（或血管）→腫瘤細胞在淋巴管（或血管）內運行→腫瘤細胞從管中出 來，再轉移到其他淋巴結（或毛細血管）中→到達其他組織或器官

2.細胞遷移和侵襲的檢測方法

① 細胞劃痕檢測細胞遷移

細胞劃痕是一種簡單易行的檢測細胞運動的方法，實驗成本低，可以用來檢測貼壁生長腫瘤細胞的侵襲轉移能力。 注意事項：一般做劃痕實驗，都是在無血清或者低血清狀態下培養的，否則細胞增殖就不能忽略。

按照6孔板背後畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點，作為固定的檢測點，這就解決了前後觀察時位置不固 定的問題。

② Transwell檢測細胞遷移和侵襲

細胞遷移與侵襲實驗將Transwell小室放入培養板中，小室內稱上室，培養板內稱下室，上下層培養液以聚碳酸 酯膜相隔，將研究的細胞種在上室內，由於聚碳酸酯膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞， 應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研 究。侵襲實驗需鋪Matrigel，而遷移實驗不需要。

六、腫瘤血管形成

1. 腫瘤血管生成的定義

血管生成是腫瘤發生過程中新血管的形成。它是指源於已存在的毛細血管和毛細血管後微靜脈的新的毛 細血管性血管的生長。腫瘤血管生成是一個極其複雜的過程，一般包括包括血管內皮基質降解、內皮細胞移 行、內皮細胞增殖、內皮細胞管道化分支形成血管環和形成新的基底膜等步驟。

2.體外管形成實驗方法

細胞實驗方法描述

具體從以下四個步驟弄清細胞實驗方法描述

1.文獻檢索

2.方法確認

3.方法提取

4.方法完善

案例分析：

miR-488靶向調控FZD7基因介導wnt信號通路對胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲

1、文獻檢索

（關鍵詞查找文獻了解相關對象的檢測內容）

miR-488靶向調控FZD7基因介導wnt信號通路對胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲。

2、方法確認

（確認相關對象的檢測方法）

方法一： 關鍵詞搜索(於百度學術)

方法二：圖片搜索(PMC和OPEN)

PMC：搜索NCBI-選擇PMC，輸入關鍵詞,看圖找方法

網址：https://www.NCbi.nlm.nih.gov/pmc/?term=

OPEN：輸入關鍵詞，看圖找方法

網址：https://openi.nlm.nih.gov

方法三： 試劑盒查找文獻或方法

關鍵詞搜索相關方法的試劑盒；

根據公司網站查找文獻或具體方法步驟。

3、方法提取

（中文文獻參考，英文文獻為主提取實驗方法。）

① 中文文獻參考，英文文獻為準

② 關鍵信息需明確

4、方法完善

（包括特殊方法特殊說明； 試劑儀器需明確；分組，時間點，劑量不能少。）

具體說明：

CCK-8檢測細胞增殖通過 CCK-8 試劑盒（96992-500TESTS-F ，Sigma，美國）檢測 miR-488 對 MKN-45胃癌細胞增殖的影響。將 MKN-45細胞接種於96孔板中， 將實驗分成空白對照組(未處理組) 、miR-488 mimic NC ( miR-488表達對照組)和 miR-488 mimic (miR-488表達組) ， 分別於1、2、3、4d 進行 CCK-8 檢測。 每孔中加入 10 μL CCK-8， 孵育3.5h後利用酶標儀（Safire2，TECAN，瑞士）在 450nm處檢測光密度值[D(450)] ，每次實驗重複3次。

注意事項：

1、實驗對象需明確

2、相關分組需明確；

3、劑量、濃度以及檢測時間點需明確；

4、實驗重複次數需表明

5、試劑、設備需明確產品信息（貨號、生產商、地址）；

1）參考文獻產品信息

2）選擇相關試劑盒產品信息

3）百度搜索產品信息（選擇國外公司為主）

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【6種細胞實驗與方法描述】

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