想發SCI，這些常規細胞實驗一定要知道
在我們日常實驗中，細胞實驗是每一個課題都必不可少的一部分。但作為一個科研小白，在面對細胞實驗時總是束手無策，所以我整理了常規細胞實驗技術，以供大家參考。
1. MTT法：是一種檢測細胞存活和生長的方法。該方法已廣泛用於生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟、快捷。原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞碸（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數範圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。
2. CCK-8法:可用於簡便而準確的細胞增殖和毒性分析，常用於藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。原理：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
3. Brdu: 即5-Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期，S期活體注射或細胞培養加入。而後利用抗Brdu單克隆抗體ICC染色顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物雙重染色可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學有重要意義。但由於抗體分子量大，難於摻入並被有效檢測。因此BrdU檢測需採用DNA酶或HCl或加熱使DNA變性。這些處理方法會破壞抗原識別位點，此外許多細胞周期分析的染料都需要dsDNA這種處理方法也使得同一樣本無法同時進行細胞周期分析。對於植物細胞等有細胞壁的分析。採用抗體檢測還需要消化細胞壁，細胞壁消化酶常含有一些雜質，會導致檢測的可靠性降低，同時BrdU檢測則需要進行長時間的孵育--幾個小時甚至過夜。
4. EDU: 即5-Ethynyl-2』- deoxyuridine, 是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在複製的DNA分子中。通過基於EdU與Apollo螢光染料的特異性反應快速檢測細胞DNA複製活性，適用於細胞增殖、細胞分化、生長與發育、DNA修復、病毒複製、細胞標記示蹤等方面的研究，尤其適合進行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實驗。
ANNEXIN V-PI法: 在正常細胞中，磷脂醯絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂醯絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂醯絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂醯絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V進行螢光素（EGFP、FITC）標記，以標記了的Annexin V作為螢光探針，利用螢光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處於不同凋亡時期的細胞區分開來。
膜片鉗技術被稱為研究離子通道的「金標準」。是研究離子通道的最重要的技術。目前膜片鉗技術已從常規膜片鉗技術（Conventional patch clamp technique）發展到全自動膜片鉗技術（Automated patch clamp technique）
原理：膜片鉗技術是用微玻管電極（膜片電極或膜片吸管）接觸細胞膜，以千兆歐姆以上的阻抗使之封接，使與電極尖開口處相接的細胞膜的小區域（膜片）與其周圍在電學上分隔，在此基礎上固定點位，對此膜片上的離子通道的離子電流（pA級）進行監測記錄的方法。用場效應管運算放大器構成的I-V轉換器是測量迴路的核心部分。在場效應管運算放大器的正負輸入端子為等電位，向正輸入端子施加指令電位時，由於短路負端子以及膜片都可等電位地達到鉗制的目的，當膜片微電極尖端與默片之間形成10GΩ以上封接時，其間的分流電流達到最小，橫跨膜片的電流可100%作為來自膜片電極的記錄電流（lp）而被測量出來。
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1. Transwell：是一種侵襲實驗技術，其實原理簡單地說就是用一層膜將高營養的培養液和低營養的培養液隔開，細胞放在低營養的培養液裡，為了找吃的，細胞會往高營養的培養液裡面跑，但是有膜擋著，所以要穿過膜才行。我們在膜上塗上一層基質膠，模仿細胞外基質，於是細胞要把基質消化了才可以從低營養的培養液跑到高營養的培養液裡面，最後我們檢測高營養的培養液裡細胞量就可以知道細胞的侵襲能力了。
2. 劃痕實驗：是簡捷測定細胞遷移運動與修復能力的方法，類似體外傷口癒合模型，在體外培養皿或平板培養的單層貼壁細胞上，用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央區域劃線，去除中央部分的細胞，然後繼續培養細胞至實驗設定的時間（例如72h),取出細胞培養板,觀察周邊細胞是否生長(修復)至中央劃痕區，以此判斷細胞是否生長(修復)至中央劃痕區，以此判斷細胞的生長遷移能力，實驗通常需設定正常對照組和實驗組,實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別，通過不同分組之間的細胞對於劃痕區的修復能力，可以判斷各組細胞的遷移與修復能力。
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1. 軟瓊脂克隆實驗：細胞接種存活率只表示接種細胞後貼壁的細胞數，但貼壁後的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由於細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。並且克隆形成率與接種密度有一定關係，做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在碟皿中，持續一周，隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養。軟瓊脂克隆形成實驗採用腫瘤細胞系或轉化細胞系，通過觀察細胞在軟瓊脂中的細胞集落形成能力，對其可能發生轉化並在動物體內的成瘤性潛能進行評價。
1. pNPP的酶活檢測：對硝基苯酚酯(4-Nitrophenyl ester)是脂肪酶水解活力測定中運用最為廣泛的一種底物,脂肪酶水解其產生pNP(對硝基苯酚)在鹼性條件下顯黃色,在410nm下有吸光值,且靈敏度很高。
2. 明膠酶譜實驗：細胞外基質（ECM）是細胞生存的重要內環境，不僅含有膠原、糖蛋白、蛋白多糖等成分，而且含有大量的蛋白酶、細胞因子、黏附分子。ECM，尤其是其中的基底膜，是腫瘤轉移過程中必須克服的生理屏障。基質金屬蛋白酶家族（MMPs）可以降解細胞外基質，幫助腫瘤細胞克服這一屏障並為細胞增殖提供空間。MMP2、MMP9是主要降解基底膜上IV型膠原和明膠的基質金屬蛋白酶類，與惡性腫瘤浸潤轉移的關係尤為密切，通過蛋白電泳即可檢測MMP2，MMP9的活性。
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3. PKC活性檢測實驗：分離PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用試劑盒組分將2種蛋白分離並加以區分，利用電泳瓊脂糖凝膠技術顯示2種不同的蛋白，利用分析軟體將顯示的不同蛋白定量並加以比較，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值顯示PKC活性（PKC活化度）。
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