通過研究免疫細胞的激活，科學家可以了解人體對特定感染、自身免疫疾病或癌症的反應方式，這在開發更有效的疫苗和治療方法方面發揮著直接作用。當捕捉免疫細胞激活的信息時，流式細胞術由於其通用性、易用性和數據生成的便捷性，無疑是一種金標技術。流式細胞儀分析單個事件並以每秒數千個事件的速度記錄多個參數。通過對這些數據集的查詢，可以在很短的時間內對數千個細胞進行量化，從而得到統計上可靠的數據，甚至有儀器可以用來觀察多達27種不同的螢光染料。
準備工作
在開始免疫細胞激活實驗之前，有幾個參數需要考慮。
首先，需要為實驗確定目的細胞，將它們從混合細胞種群中分離出來，還是使用細胞表面標記將它們與其他細胞類型區分開來。
此外，需要確定刺激方法，例如，靶細胞、化學物質、抗原多肽，這將影響如何檢測發生的激活。例如，如果用靶細胞刺激目的細胞(尋找細胞毒性能力)，則脫粒試驗更為合適，而化學和抗原刺激則更適合增殖研究。
最後，要注意激活免疫細胞會導致表型、基因調控以及功能的改變。
本文介紹三種最常用的通過流式細胞術檢測免疫細胞活化的方法。
1. 表面抗體染色
在遇到病原體之前，免疫細胞處於靜止狀態。外來病原體的刺激或暴露於促炎環境中，可導致細胞內信號級聯反應，並最終導致細胞表面蛋白的改變。
例如，當有合適的抗原時，未成熟的T細胞將被刺激產生成熟標記(如CD69, CD25)，這些標記有助於這個新分化的效應細胞的增殖，表面蛋白表達的變化可用流式細胞術測定。關於細胞功能(如增殖、促/抗炎症細胞因子生成、細胞毒蛋白生成)的更多信息，可以結合表面抗體染色和細胞內細胞因子染色。
2. 胞內細胞因子染色
任何免疫反應都有4個主要特徵：發熱；疼痛；腫脹；發紅。這些生理特徵是免疫細胞大量湧入感染部位的直接結果，因為前哨細胞遇到異物釋放了細胞因子。細胞因子是一種小蛋白，在細胞間的通訊、免疫細胞的運輸和環境的設定中起重要作用(如促炎vs .抗炎)。
細胞因子檢測使研究人員能夠研究特定抗原刺激的反應，流式細胞術的使用提供了一種能力，以確定哪些特定細胞類型正在產生哪些細胞因子。為了達到這一目的，首先對受刺激的細胞使用一種阻斷蛋白質運輸的物質，如布雷菲德菌素A或莫能菌素，然後對其進行固定和滲透，使細胞因子特異性抗體達到其靶點。使用直接偶聯螢光基團的抗體來標記細胞內細胞因子，它們通常比細胞表面蛋白要少，這將是檢測它們存在的最佳機會。
3. 細胞增殖
在對病原體作出反應後，免疫細胞將被激活並增殖以增加其種群數量。這是一個重要的研究點，特別是當試圖發現在特定的感染過程中，哪種免疫細胞數量增長最快，或者不同齡細胞如何在細胞激活反應中發揮作用。
Ki-67：核蛋白Ki-67在細胞周期活躍期上調，是一種常用的檢測細胞增殖的標誌物。與其他方法相比，這種方法非常容易使用，但通常會造成高背景，這在細胞儀的實驗設置和數據分析過程中需要注意。
BrdU：研究增殖的一種方法是標記正在複製的DNA。傳統的檢測方法是使用放射性標記的胸苷，在複製過程中它可以被整合到DNA中，然後用液體閃爍法檢測。然而，基於放射性的分析方法有很大缺陷，為了避免這種危險，BrdU是一種好的選擇，BrdU也可以與複製細胞的新合成DNA結合（S期）。偶聯螢光的BrdU抗體用於流式細胞術檢測BrdU，但BrdU可能會引起DNA突變。
染料稀釋法：染料稀釋法是利用染料對細胞蛋白進行螢光標記。CFSE是一種細胞滲透性染料，它與細胞內的分子共價結合，使CFSE在細胞內保持較長時間。隨著細胞的分裂，CFSE也在分裂，細胞的每一次分裂都被觀察到CFSE螢光在前一階段的一半。該方法簡便易行，可與流式細胞儀上的其他細胞表面染色相結合。CFSE是非常明亮的，因此在與其他螢光染料結合時需要謹慎使用，以確保使用了正確的補償和門設置。由於CFSE和GFP具有相同的激發/發射光譜，因此在同一實驗中不能同時使用它們。還有一些染料與CFSE類似，用於研究染料稀釋方法，但具有不同的激發和發射譜，因此可以與GFP或其他螢光蛋白結合使用。
流式細胞術是研究多種條件下免疫細胞活化的重要工具。因為流式細胞術允許每秒檢查數千個細胞，所以可以非常迅速地收集大量數據。隨著越來越多的流式細胞儀的出現和越來越多的螢光染料的出現，檢測免疫細胞的活化會越來越方便。
文章來源：每日生物評論
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