第五節 癌胚抗原的免疫細胞化學

第五節　癌胚抗原的免疫細胞化學

　　一、癌胚抗原的特點

　　癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）是分子量約20萬的糖蛋白，具有二級以上結構。不同腫瘤中提取的CEA雖然抗原性相似，但所含唾液酸及其它糖組分的含量不一定相同，故有多個抗原決定簇，能與非特異性反應抗原NCA、NCA-2和正常胎兒糞抗原等發生交叉反應。NCA存在於正常肺、胰腺、粒細胞、單核細胞及巨噬細胞內，也存在於正常腸黏膜、胃黏膜腸化生腺體細胞及膽汁內。臨床血清學檢查CEA對結腸癌、肺癌、胰腺癌、胃癌及其它腺上皮性惡性腫瘤等的診斷有較大價值。免疫細胞化學研究可以明確CEA的定位和分布，也可以通過組織切片和分泌物塗片進行臨床診斷和鑑別診斷。

　　二、癌胚抗原的免疫細胞化學染色

　　1．組織加工有人提出用冰凍切片進行CEA免疫細胞化學染色。由於非特異性螢光和需要一定設備條件，有人改用福馬林固定和胰酶消化的方法。從我們的體會看，福馬林固定後的切片CEA的部分抗原決定簇被遮蓋，陽性結果顯著受到影響。但是用冷酒精固定後的組織切片，CEA的陽性率明顯升高，而且結果仍很清晰。goldenbery等同時進行CEA酶標記組織，而福馬林固定的組織切片中CEA檢出範圍為3.0～7.0ng/g組織，酒精固定的組織切片比福馬林固定者敏感2～3倍。有趣的是我們用酒精固定26個月的切片進行染色，效果仍然很好。說明冷酒精固定法便於進行回顧性研究。雖然酒精固定後組織收縮比較明顯，但不影響組織結構及形態，而且可以進行多種抗原的定位研究，操作簡單，是值得推薦的一種組織固定方法。冷酒精固定方法和步驟同抗體產生細胞的研究。

　　2．染色方法的選擇根據實驗條件和抗體特點選擇染色方法。PAP和ABC技術可以採用，但試劑價格較昂貴，步驟較複雜。我們認為間接螢光或間接酶技術即可獲得滿意結果。間接酶染色技術步驟如下：

　　（1）冷酒精固定的組織石蠟包埋，組織切片，常規脫蠟後在PBS中放置5min，過一次蒸餾水清除玻片上的沉澱物後風乾，加含3%H₂O₂甲醇一滴在切片上，放置20min後再PBS衝洗3次，過蒸餾水後風乾。

　　（2）加稀釋好的兔抗CEA血清（稀釋度根據染色工作效價）在37℃溼盒內放置45min。

　　（3）PBS清洗3次後風乾，再加HRP標記物的羊抗兔IgG（稀釋度也要根據染色工作效價），37^℃溼盒內放置45min。

　　（4）PBS清洗3次後加新鮮配製的含3%H₂O₂pH7.6Tris緩衝液（10ml溶液中含二氨基聯苯胺5mg）中暗處反應5～8min（邊反應邊在顯微鏡下觀察），自來水衝洗，用1%甲基綠復染2～5min，再次自來水衝洗，常規脫水、透明和封片，在光鏡下觀察。

　　3．陽性結果判斷及計數檢查前應當對CEA的分布有一定理性認識，而且用正常結腸組織和陽性組織作對照觀察。CEA以三種形式出現在胃腸道組織切片中：①腔面分布。沿腺腔面的胞漿有棕紅色酶著色。這是胃黏膜中腸上皮化生腺體、高分化腺癌和正常結腸腺體的CEA分布形式。②胞漿分布。在低分化粘液細胞癌中，CEA多位於胞漿。③粘液分布。在高分化腺癌的腺腔和粘液細胞癌周圍的粘液中有CEA著色。

　　4．腹水免疫細胞化學染色臨床上鑑別良惡性腹水可採用免疫細胞化學技術。抽取200～300ml腹水，離心後取細胞沉澱進行直接塗片、乾燥、酒精固定後採用間接螢光染色。具體的方法是：在腹水塗片上加兔抗CEA抗血清（1：25稀釋，稀釋液為BPS緩衝液），在37^℃溼盒內放置45min後BPS衝洗，共10min，再加入FITC標記的羊抗兔IgG（1：20稀釋，稀釋液為0.1%伊文氏藍緩衝液），在37℃溼盒內放置45min後，PBS衝洗3次，共10min，用50%甘油封片，螢光顯微鏡觀察。有綠色螢光陽性細胞的片子再進行HE染色，做對照觀察和判斷。也可以將細胞沉澱物在試管內直接進行間接螢光染色（方法同T淋巴細胞染色）。我們發現，不論採用哪種方法，都可能出現非特異性著色。少數淋巴細胞也能出現螢光或酶著色。其機理尚不清楚，如果採用伊文氏藍作對比螢光染色，可明顯減少非特異性螢光，而且淋巴細胞較小，腺癌細胞較大，有利於進行鑑別診斷。

　　三、臨床意義

　　免疫細胞化學技術可以確定CEA的組織發生部位，根據陽性特點可以判斷癌細胞的位置。我們的研究發現正常結腸組織CEA為弱陽性，多非常清晰分布在腔面。但結腸癌組織中CEA著色帶較寬，多為強陽性，而且不規整。對胃黏膜的研究發現正常胃腺體均為陰性，腸化生腺體細胞弱陽性。胃腺瘤細胞也含有CEA。70%以上胃癌細胞CEA強陽性，特別是粘液細胞癌，光鏡下癌細胞分散浸潤，無法確定其轉移及浸潤範圍。用免疫螢光或免疫酶技術進行染色，根據陽性細胞分布可作出正確判斷。在肝臟或其它部位轉移癌有時因細胞分化不良，無法確定其組織來源。如果用免疫細胞化學染色，發現CEA陽性細胞說明來源於腺上皮的癌腫，可能來自胃腸道或卵巢等組織。用胸腹水進行免疫細胞化學染色對臨床診斷有實用價值。Walts對26例腫瘤病人滲出液和抽吸液離心後做免疫酶染色，發現13例有CEA陽性細胞。11例常規細胞學檢查陰性的腫瘤病人發現8例胸腹水中有CEA陽性細胞。如果膽高CEA抗體的特異性，改進組織加工方法，排除非特異性著色，可望提高診斷價值。已經有人在血清學監測CEA診斷胃腸道腫瘤的基礎上，將CEA標記¹²⁵I進行放射掃描定位診斷和用CEA標記¹³¹I或抗癌藥物進行腫瘤治療的報導。