第四節 原位雜交組織化學與免疫細胞化學結合法

第四節　原位雜交組織化學與免疫細胞化學結合法

　　原位雜交組化（ISHH）與免疫組織化學（IHC）結合法是先後用ISHH和IHC在同一切片或兩個相鄰切片進行染色，這樣就可以同一細胞中顯示出某種mRNA和相應的蛋白、多肽或其它抗原，從而可更好地了解某一基因的轉錄和蛋白、多肽合成的動力學。ISHH與IHC結合法可以在相鄰切片上分別進行ISHH和IHC染色，也可先後在同一切片上進行ISHH和IHC染色。前者可使ISHH和IHC染色都獲得理想的結果，易成功，但易產生空間誤差和樣本誤差。在同一切片上進行結合法可克服這些誤差，但第一次染色總要或多或少地影響第二次染色，使第二次染色不十分理想。由於m RNA易被染色過程中汙染有少量RNase的液體所降解，因而在實踐中往往首先進行原位雜交組化染色，這種次序使結合法易成功。但在操作方法中應注意減少生物活性肽或蛋白的丟失，如在雜交後衝洗中適當減低漂洗溫度。

　　一、同位素原位雜交組化與免疫組化PAP法的聯合程序

　　（1）切片入PBS衝洗5min，最好是將切片漂洗於滅菌器皿中。

　　（2）0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。

　　（3）0.4%Triton X-100 PBS 15min。

　　（4）1μg/ml蛋白酶K，37℃保溫30min。

　　（5）4%多聚甲醛PBS固定5min 。

　　（6）PBS衝洗2×3min。

　　（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配）10min。

　　（8）2×SSC衝洗10min。

　　（9）雜交：如是cDNA探針用前需進行變性處理，載片法時將切片在空氣中晾乾，加含探針的雜交液10μl於切片上，蓋上22×22mm的矽化蓋片或相當大小看蠟膜，³H標記探針每10μl雜交液含1×10⁵cpm探針，³²P或³⁵S標記探針每10μl雜交液含5×10⁵cpm探針；如是漂浮切片，則用滅菌吸水紙將切片水份儘量吸乾，然後入雜交液，探針濃度和載片法一樣。入雜交液後43℃保溫12～16h。

　　（10）4×SSc 37℃衝洗10～30min。

　　（11）2×SSC（如為RNA探針則含20μg/ml RNase）37℃衝洗30min。

　　（12）1×SSC和0.1×SSc 37℃分別衝洗30min。

　　（13）PBS衝洗2×5min。（轉錄ISHH）

　　（14）0.5%H₂O₂ PBS室溫30min。

　　（15）1%BSA 37℃，30min 。

　　（16）第一抗體，4℃孵育16～24h。

　　（17）PBS衝洗4×5min。

　　（18）第二抗體37℃，1h。

　　（19）PBS衝洗3×5min。

　　（20）兔PAp 37℃，1h 。

　　（21）PBS衝洗3×5min。

　　（22）DAB顯色液5～10min（DAB顯色液：0.05%DAB + 0.03% H₂O₂ PBS液配）。

　　（23）PBS衝洗3×5min。如是漂浮切片則將其貼於塗有粘附劑的載片上，晾乾。

　　（24）切片入70%，85%，95%和2個100%酒精脫水，空氣乾燥。

　　（25）在暗室塗布乳膠（乳膠配製：乳膠原液：0.6mol/L醋酸胺=1：1），晾乾，裝入自顯影暗盒。

　　（26）4℃曝光：³H標記探針4～8周，³⁵S標記探針1～4周，³²P標記探針7～10天。

　　（27）D₁₉₆顯影液，20℃顯影5～10min。

　　（28）自來水衝洗數秒。

　　（29）F₅堅膜定影液10min。

　　（30）自來水衝洗15min。

　　（31）切片溫箱烤乾，脫水，透明，封片。

　　結果：蛋白或多肽免疫反應陽性細胞為棕色胞質，而其相應mRNA為黑色銀顆粒聚集。

　　二、非同位素原位雜交組化與免疫組化聯合法

　　非同位素標記物很多例如：生物素（biotin），地高辛（Digoxigenin），汞（mercury），溴（bromine）和鹼性磷酸酶等，其中目前應用最多的是生物素和地高辛。將此法與免疫組化PAP法或ABC法聯合使用，能成功地顯示一些神經肽mRNA和神經肽的共存與共同分布。向正華等發現鹼性磷酸酶抗地高辛抗體是經木瓜蛋白酶處理的，只有抗體的Fab段沒有Fc段，而免疫細胞化學（Immunocytochemistry,ICC）所應用的抗體既有Fab段，又有Fc段。由於抗體的這一特性可在ISHH和ICC抗體孵育時將檢測核酸的抗地高辛抗體Fab段與檢測蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起，一同孵育切片，這樣可明顯縮短ISHH和ICC結合法的實驗周期，同時還可以減少實驗過程中對ICC檢測的蛋白、多肽的損害，使結合法易成功。為什麼兩種抗體可同時混合孵育切片，這是因為抗地高辛抗體只有Fab段，而沒有Fc段。我們知道抗體的抗原決定簇在Fc段，因此第二抗體與第一抗體的結合是第二抗體的Fab與第一抗體的Fc，所以第一抗體如果只有Fab段沒有Fc段，那麼第二抗體就無法與一抗結合。因此實驗中將二種抗體混合孵育切片而不會產生交叉結合。以下為此法的原理圖（圖20-5）。

圖20-5　原位雜交細胞化學與免疫細胞化學結合法

　　此種ISHH與ICC聯合法穩定，實驗周期短，藍色與棕色反差強，是目前較好的ISHH與ICC結合法。詳細程序如下：

　　（1）將切片漂浮於能經受高壓滅菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2衝洗3×5min。

　　（2）0.1mol/L甘氨酸PBS衝洗5min。

　　（3）0.4% Triton X-100 PBS 15min。

　　（4）1μg./ml蛋白酶K（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配），37℃保溫30min。

　　（5）4%多聚甲醛PBs 5min。

　　（6）PBS衝洗2×min。

　　（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配）10min。

　　（8）2×SSC衝洗10min。

　　（9）將切片用滅菌吸水紙吸乾，然後入雜交液。核酸探針濃度為0.25～0.5μg./ml。每一正常成年大鼠腦冠狀切片15μl雜交液足夠。43℃保溫12～16h。

　　（10）4×SSc 37℃衝洗30min。

　　（11）2×SSC（含RNasea 20μg/ml）37℃保溫30min。

　　（12）1×SSC和0.5×SSc 37℃分別衝洗30min。

　　（13）0.05mol/l PBS衝洗3×5min。

　　（14）0.5%H₂O₂ PBS室溫20min。

　　（15）0.05mol/l PBS 衝洗2×5min。

　　（16）鹼性磷酸酶標記抗地高辛抗體（Fab）與抗蛋白或多肽等抗體混合液，前者一般1：1000稀釋，後者則因抗體而異。稀釋液：1%BSA，0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBS pH7.2，4℃孵育24h。

　　（17）0.05mol/l PBS衝洗4×5min。

　　（18）二抗（1：100～1：200）37℃保溫1h。

　　（19）0.05mol/l PBS衝洗3×5min。

　　（20）PAP（1：200～1：400）37℃保溫1h。

　　（21）0.05mol/l PBS衝洗3×5min。

　　（22）DAB顯色液（0.05%DAB + 0.03% H₂O₂,0.05mol/L PBS pH7.2配）顯色5～10min。

　　（23）0.05mol/l PBS衝洗3×5min。

　　（24）TSM，衝洗2×5min（TSM₁：0.1mol/l Tris – HCl pH8.0,0.1mol/L NaCl,0.01mol/L MgCl₂）.

　　（25）硝基四氮唑藍（400μg/ml）和5-溴-4-3-吲哚磷酸（200μg/ml）混合液（TSM₂配顯色混合液）顯色1～3h，避光。

　　（26）20mmol/l EDTA終止顯色。

　　（27）將切片貼於塗有鉻礬明膠的載片上，空氣乾燥。

　　（28）梯度酒精脫水，透明、封片。

　　結果：ISHH陽性細胞的胞質呈紫藍色，胞核不著色，示該細胞含XmRNA。ICC陽性細胞的胞質呈棕色，胞核不著色示該細胞含X多肽。雙標記細胞的胞質為藍棕混合色，示多肽與mR－NA共存於該細胞內。