來源：來源網絡 2007-09-06 22:38
原位雜交技術能在目的細胞和組織中觀察基因和分析基因的缺失,增減和變異,使傳統的基
礎醫學和臨床醫學研究推進到基因分子認識水平.尤其是RNA原位雜交已成為最有效的分子
工具.從培養細胞檢測結果表明,採用螢光素標記探針結合CCD攝錄的圖象分析處理系統,
原位雜交的分辯率已達到1kb靶DNA的靈敏度.而在冰凍和石蠟切片中原位雜交的靈敏度遠不如培養細胞,靶DNA僅為40kb,而mRNA為10-20拷貝.如何提高組織切片中雜交信號的敏感度已成為當今原位雜交技術研究的熱點,採用寡核苷酸與多種cRNA探針似雞尾酒混合方式,以同一序列合成不同探針來提高雜交的靈敏度.其次為組織前處理的改進,RNA原位雜交和免疫組化並檢技術和雷射共聚焦顯微在多重RNA原位雜交中應用等.
(一) 組織前處理的改進
RNA原位雜交中組織固定多推薦 4% 多聚甲醛,固定時間不超過24小時,尤以冰凍切片為佳.1998年Liu[8]比較了同一腎組織和肺組織,用4% 多聚甲醛和10% 中性福馬林固定,石蠟切片和冰凍切片中RNA原位雜交檢測結果.按0.5,4,16和48小時時間段檢出雜交信號,經圖象分析系統處理並比較陽性率,陽性強度和雜交信號定位等表明:(1)固定36,48小時時間段,石蠟切片組結果好於冰凍切片組;(2)中性福馬林固定與多聚甲醛無明顯差異.同樣的結果還見於Le[9] 在甲狀腺組織腫瘤的研究.這些報導為外檢病理標本作回顧性RNA原位雜交開闢廣闊應用前景.
(二) 雜交信號放大
通過原位PCR方法來擴增靶RNA核苷酸片段來提高原位雜交的
敏感性,從理論上講也是成立的.但從近幾年應用結果表明主要存在以下問題:(1)如何避
免擴增後核苷酸向細胞外彌散,引起雜交信號的定位錯誤.(2)擴增後核苷核又如何得到有
效標記,尤其是低敏感度擴增產物的標記.(3)如何預防凋亡細胞和RNA酶處理後切片中核碎
片即非目的核苷酸片段擴增.(4)如何保持細胞形態和組織結構的完整性.(5)如何克服在應
用微波和熱處理中使9號染色體著絲點破壞所造成的假陽性.總之通過原位PCR,微波和熱處理方法來提高靶細胞核酸數量或增加敏感性在應用中尚存在著異議[11-12].
TSA是酪胺醯胺信號放大(Tyramide Signal Amplification)的縮寫,而CARD則是催化報導基因*沉澱(Catalyzed reporter deposition CARD)的縮寫(*報導基因:處於另一基因下遊並
可反映轉錄上遊基因表達水平的基因).前者名稱側重酪胺醯胺的放大作用命名[10-11].19
89年Bvbrow首先將TSA應用到斑點雜交和ELISA中來提高檢出信號的敏感度.1995年由Kerstens[15] 和1997年Speel[13,18]等又將TSA引用到原位雜交中,因為檢測低拷貝的RNA往往得不到有效的雜交信號,而TSA則使原位雜交的靈敏度提高了2-100倍,能在組織切片中檢出多拷貝和單拷貝1-5kb的DNA 序列為低豐度的mRNA 和rRNA檢測奠定了基礎.從而在近兩年內使RNA原位雜交技術得到穩步發展並展示廣闊的應用前景. 1997年Schmidt[16]首先提出了CARD的命名,1999年 Yang[11]和Speel[13]綜述了CARD在原位雜交中的應用.對酪胺醯胺的放大的原理和應用作了詳盡描述:(1)低濃度的酪胺醯胺在辣根過氧化物酶活性和H2O2的作用下,通過催化報導基因使酪胺酶分布在原位雜交點或雜交點附近,使大量半抗原分子(生物素,地高辛,二硝基苯(dinitrophenyl)和螢光素介入而達到雜交信號放大.(2)而高濃度的酪胺醯胺在辣根過氧化物酶活性和H2O2的作用下催化報導基因直接發生沉積,使顯色的面積增大而達到信號放大.(3)半抗原標記的探針與靶核苷酸雜交與抗半抗原抗體結合的辣根過氧化物酶 (HRP)反應又與螢光素標記的酪胺酶結合在螢光顯微鏡直接顯示.(4)生物素標記或半抗原標記的酪胺醯胺通過鏈菌抗生物素,卵白素等通過間接放大顯示[15].
TSA或CARD是一種容易,快速,高度敏感和有效的提高雜交信號放大系統[10-18].尤其是不需要改變原有雜交實驗流程,在雜交後加入或與螢光素,鏈菌素抗生物素相連接,以DAB等為底物,避免了 NBT/BCIP 在二甲苯中透明引起信號褪色,因此為技術人員所接受,而高敏感度和良好的定位更為病理學家所接受,而且為常規福馬林固定的標本中開展以診斷為目的的雜交檢測創造了條件,也為雜交信號計算機圖象自動化處理應用開拓了應用前景.但應用TSA或CARD時應遵循以下幾點:(1)按探針種類和不同組織類型在參考有關文獻後作出.a.在探針雜交後應用,參考TSA試劑盒稀釋濃度,在37℃ 或常溫下孵育 5-15min,預處理中需抑制內源性過氧化物;b.酪胺醯胺結合螢光素可作直接顯示;c.酪胺醯胺結合生物素,地高辛,螢光素,鏈菌素抗生物素,卵白素作間接顯示其放大效果高於直接顯示.(2)最佳信/噪比(Signo-to-noise ratio)和獲得最大放大效果,在標準化原位雜交流程下進行,應適當調整探針濃度和免疫組化流程.(3)為獲得最大限度信號放大,多採用間接顯示法.通過鏈菌素抗生物素,酶和卵白素等增加雜交信號檢出.(4)可採用葡聚糖或高分子量聚乙烯醇[24](
Polyvinyl alcohol)增加酪胺醯胺定位和加速顯色反應.(5)雜交後固定應省略,越來越多
研究表明,雜交後固定可導致雜交信號減弱.總之TSA或 CARD不但能促使原位雜交技術的發展,尤其是在RNA原位雜交中顯示無與論比的應用前景.
(三) RNA原位雜交與免疫組化雙重檢測技術
Fransje[19]報導了在正常表皮,剝落上皮和牛皮癬上皮的組織切片中先後作RNA原位雜
交檢測其組蛋白表達,同時用MIB作免疫組化標記檢測細胞增值率,以闡述各組表皮的組蛋
白表達與細胞動力學的關係.這種檢測的設計非常完美,但檢測技術較為繁雜.因為一般抗
血清中含有較多的RNA酶,若先進行免疫組化,需加入核酸酶抑制劑,先進行原位雜交,雜交
液中不宜含聚蔗糖,否則會增強免疫組化的染色背景.雜交前的預處理和雜交後的洗脫不宜
過度,以免抗原變性或丟失.RNA原位雜交與免疫組化並檢,一般先作原位雜交檢測,後作
免疫組化檢測[19-22].
(四) 多重RNA原位雜交技術
Grino[23]運用雷射共聚焦顯微鏡,成功地將標以同位素[s35]-UTP,地辛高-UTP和生物素-UTP三種cRNA探針,在下丘腦旁室核單個神經原細胞中檢出促腎上腺皮質激素釋放因子(Corlicotropin releasing factor),精氨酸後葉加壓素(Arginine vasopressin)和Peptidylycin, α-amidating monooxygenase mRNA.在一張組織切片中進行多種RNA雜交的目的是研究某個細胞與相關細胞內基因表達水平,以及它們之間相互聯繫,有重要應用價值.切片在10μm以上,在組織前處理,預雜交以後,可將幾種雜交探針同時加入進行雜交,然後按各種標記的要求作免疫反應,並以不同方法依次顯色,是難度極高的RNA原位雜交.
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