第八節 免疫膠體鐵細胞化學
膠體鐵（Ferric Colloid）是一種陽離子膠體，可通過普魯士藍反應呈色，其顆粒有一定的大小及電子密度，最初被用於光鏡及電鏡下定位組織中的陰離子部位（Hale,1946Seno,etal, 1983,Murakami， et al 1986）。1989年日本學者Seno等在抗體分子上標記了膠體鐵，將膠體鐵引入免疫細胞化學技術（Seno,et al. 1989）。楊守京等在膠體的製備方法及其標記物的純化等方面做了改進，成功地用於流行性出血熱病毒抗原的檢測（楊守京，等，1992）。該方法具有較高的特異性與敏感性，背景染色乾淨。
一、膠體鐵的製備方法
早期製備的膠體鐵作為陽離子膠體是用於檢查組織中陰離子的定位，其製備主要是通過三氯化鐵（FeCl3）的煮沸完成的，如有：（1）FeCI3直接煮沸（Hale ,1946）:(2)FeCl3溶於甘氨酸和氨水的混和液中（Rinehart,1951）:(3)FeCl3倒入煮沸的二甲坤酸鈉溶液中（Seno.et al,1983）。或FeCl3與二甲砷酸溶液一起煮沸（Seno ,et al.1985）其後，製備方法不斷改進，1986年Murakam 等用水合聯胺二甲砷酸-FeCl3煮沸法製備出微細顆粒膠體鐵（Fine-granular cationic iron col loid）,膠體顆粒小（0.5～1nm）,從而使其穩定性及穿透能力大大增加(Murakarmi,et al.1986)。用二甲砷酸代替二甲砷酸鈉也可以獲得同樣膠體，具體步驟如下：在60ml 0.1mol/LFeCl33ml，將混合物加熱煮沸至變成深棕紅色為膠體砷酸鐵。室溫冷卻後，再以二倍於原體積的0.1mol/LpH7.4的二甲砷酸鈉緩衝液（Cacdylate sodium Buffer pH7.4,CB）稀釋，即可進行抗體標記。該方法製備的鐵膠體呈深紅色，顆粒大小1nm左右，在pH4～8範圍內穩定，4℃可存放一個月以上，室溫存放半個月，陰離子定位分布同Murakami等的膠體鐵，與IR-COO-有較強的親和力，但不與IR-NH+結合。
二、抗體的標記和純化
膠體鐵的等電點為7.8至7.9,在pH7.4時通過離子鍵能與抗體IgG(pH5.8～7.3)結合而不影響抗體活性,在此條件下,Seno＇對Hale＇膠體鐵進行了抗體標記,並成功用於免疫細胞化學染色(Seno,et al.1989),抗體標記時,用0.1mol/L碳酸鉀將膠體的pH調至7.4按每毫升脫體鐵0.2～1mg的蛋白量,將IgG在電磁攪拌下逐滴加入到膠體鐵,攪拌5min後,通過CB平衡的Amber liaht CC-50層析柱,CB洗脫純化.作者在膠體鐵的製備方法進行了改進,吸收了Murakami等膠體的優點,所製備的膠體鐵,顆粒小,穩定性高,其pH值近中性,標記效果好,CM-sephadex C-50(Pharmacia)可取代Amberlight CG-50用於純化標記抗體(楊守京,等,1992)。
三、膠體鐵標記抗體的鑑定
用免疫斑點法或免疫細胞化學染色等方法可鑑定抗體的標記效果
1．免疫斑點法 在處理好的硝酸纖維素膜上分別滴加100～10-7系列稀釋的抗原，斑點直徑0.25cm, 空氣中乾燥，80℃多聚甲醛蒸氣固定1h，然後分別以膠體鐵標記的抗體一步法或用橋抗聯接膠體鐵標記物的間接法染色，普魯士藍呈色觀察。一步法所難檢測到的抗原量為10-２～10-３μg,間接法 敏感性至少增加10倍（10-３～10-４μg）。
2．免疫細胞化學染色法 步驟同下，方法敏感性同免疫金銀法（IGSS），優點是背景乾淨。
四、免疫膠體鐵細胞化學染色
（1）組織切片脫蠟入水，0.01mol/l pH7.4 PBS洗；
（2）用4%正常羊血清封閉組織37℃ ，30min。
（3）分別以第一抗體孵育組織，4℃24h，PBS振洗10min×3；
（4）用膠體鐵標記的第二抗體37℃孵育30min或用橋抗聯接膠體鐵標記物；
（5）蒸餾水洗；
（6）以1%的亞鐵氰化鉀與1%鹽酸混合液顯色20in；
（7）自來水洗 ；
（8）核固紅染核，脫水，透明、封片。
以該方法染色，陽性為藍色，胞核為紅色。
五、方法的應用
膠體鐵的呈色產物亞鐵氰化鐵是一絡合物（解離常數1×10-35），一經形成，難以再與其它化學物質發生反應。藍色的亞鐵氰化鐵與棕色的DAB產物及黑色的銀顆粒顏色對比明顯，因此強結合免疫酶及IGSS進行光鏡下抗原的雙標及多標記。膠體鐵（顆粒1nm）標記抗體直徑比常用膠體金（5～40nm）及鐵蛋白標記抗體（12nm）小，因而對固定組織具有更好的穿透力，可用於抗原的超微結構定位，尤其是免疫電鏡的包埋前染色。結合免疫酶及不同大小膠體金標記抗體，還可用於抗的雙標記及多標記。
非特異性背景染色是免疫組化染色過程中經常遇到的問題。組織中的內源性過氧化酶活性及色素常會干擾免疫過氧化酶染色；而膠體金非特異性吸附組織是構成IGSS背景染色的主要原因。膠體鐵與抗體結合呈電中性後，很少再與組織發生吸附，並且其染色不受內源酶活性的幹擾。普魯士藍反應只顯示標記的三價鐵，不能顯示組織中內源性二價鐵（除外含鐵血黃素，但可通過連續切片H·E染色對照排除），因而背景乾淨。另外免疫斑點試驗和組織染色結果表明，免疫膠體鐵間接法敏感性與IGSS基本相同但高於ABC染色，從上述兩方面看，該方法要優於免疫酶及免疫金銀染色。
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（李玉松 王泊沄 楊守京）