流式細胞儀檢測技術操作方法、試劑配方、注意事項介紹

2021-01-21 體外診斷POCT論壇

流式細胞儀（Flow cytometer ）是對細胞進行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學方面的特徵參量，並可以根據預選的參量範圍把指定的細胞亞群從中分選出來。多數流式細胞計是一種零解析度的儀器，它只能測量一個細胞的諸如總核酸量，總蛋白量等指標，而不能鑑別和測出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是說，它的細節 解析度為零。



流式細胞儀檢測技術可應用於：（1）分離和鑑定細胞群及亞群；（2）分析腫瘤細胞的DNA、RNA含量；（3）分析細胞內抗原物質。


方法原理


流式細胞儀的使用一般分為三個步驟。第一，是儀器前階段，包括試劑的準備，細胞製備、細胞的螢光染色；第二，是流式細胞儀階段，主要是儀器的操


操作步驟

一、 細胞和試劑的準備

1.  細胞樣品：來源淋巴細胞或外周血的白細胞。

2.  螢光標記單克隆抗體：常用的有FITC（fluorescein -isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）標記的單克隆抗體。

3.  封閉抗體：抗Fc受體抗體 

4.  FACS緩衝液：

1xPBS  950 ml

FCS  40 ml

10%疊氮鈉溶液  10 ml

5.  儀器緩衝液（FACS-flow）：儀器廠家提供

6.  FACS清潔液（FACS clean ）和FACS洗淨液（FACS rinse）：儀器廠家提供。


二、操作步驟 

1.  單細胞懸液的製備：將1x105~1x107的細胞放入1.5 m l離心管中3000 r/min 離心5分鐘，棄上清；加入FACS緩衝液100 ul 懸浮細胞。

2.  封閉細胞表面Fc受體：在步驟1中加入Fc受體抗體0.5 ul（0.5 mg/ml），水浴3分鐘。

3.  細胞與螢光抗體結合：在步驟2中加入螢光抗體1 ul（0.5 mg/ml），水浴30分鐘。

4.  洗細胞去除游離的螢光抗體：在步驟3中加入FACS緩衝液350 ul，輕輕混勻，3000 r/min，離心5分鐘，棄上清，重複步驟（4）2次。

5.  上樣前處理：取100 ul 儀器緩衝液加入步驟（4）獲得的細胞沉澱中，輕輕混勻懸浮細胞，將細胞懸液移入FACS專用管中，準備進行儀器檢測和分析。


三、儀器的操作

以FACSCaliburTM（BD Biosciences）儀器為例。儀器主要分為主機部分（包括雷射激活源，射流，射線探測器）和計算機部分（CELLQuest softwere）。儀器的操作分為使用前的準備、使用中的操作和使用後的清洗。

1.使用前的準備

（1）打開電源：包括系統電源和主機部分電源。

（2）檢查供液槽和廢液槽：供液槽應含足夠的儀器緩衝液，廢液槽應在上次使用後清洗乾淨。

（3）使機器處於負亞狀態，才能使細胞懸液被吸入至機器的吸管口。

（4）機器處於可應用狀態時，指示燈會變成綠色。

2.使用中的操作

（1） 計算機部分—使用CELLQuest程序系統軟體：

①設定所要檢測細胞的數量：一般設10 000~20 000個細胞。

②命名本次實驗：一般含使用者的姓名和實驗日期。

③打開記數部分：顯示進入的細胞數以及檢測一定量的細胞所需要的時間。

④將微機與主機連接：控制檢測時的預檢測和實際檢測。

⑤主機設定：一般是已設定好的適合測定淋巴細胞的條件，包括探測器的電壓。探測器的電壓是調空光電倍增管所能檢測螢光密度的範圍。

⑥選擇檢測的波長和表達方式（plot）：如果用一種螢光抗體，一般選直方圖（histogram）；如果用兩種螢光抗體，常選點狀二維圖（dot plot）或輪廓線圖（contour plot）

（2）細胞的吸入：將裝有細胞的FACS測定管放置到機器吸管孔處。

先預檢測樣品，然後進行實際檢測。可根據細胞的濃度選擇測定的速度（低、中或高）。所有的數據將自動存入微機。

3.使用後的清洗  所有樣品測定完後，要進行儀器的清洗。

（1）將裝FACS清潔液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入1分鐘。

（2）將裝FACS洗淨液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入 1分鐘。

（3）再將裝FACS清潔液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入5分鐘。

（4）同樣再將裝FACS洗淨液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入5分鐘。

（5）最後將一裝有雙蒸水的FACS管放置機器吸管孔後，關閉機器。

（6）將廢液槽中的廢液倒掉，並清洗乾淨廢液槽。


注意事項

1.  減少非特異螢光染色

（1）細胞的活性和狀態：流式細胞儀不但可探測細胞表面的螢光，也可探測細胞內的螢光。因此，如果要檢測細胞表面的分子，一定要保證細胞的活性，還應儘可能保持細胞靜止，通常在4度進行操作。否則，螢光抗體進入死細胞內，會產生非特異結果。

（2）封閉抗體的應用是必不可少的，因為大多數的免疫細胞表面都表達有Fc-R。細胞與抗體相互作用後，一定要用FACS緩衝液洗2~3次，以除去游離的抗體。

2.  單染色時以FACS最常用，FITC標記抗體螢光比較穩定而且價格合適。

3.  如果同時要檢測兩種以上的分子，一定要選擇不同波長的螢光所標記的抗體。 

其他

流式細胞儀（flow cytometer）是一種能夠探測和計數以單細胞液體流形式穿過雷射束的細胞檢測裝置，由於在檢測中使用的細胞標誌示蹤物質為螢光標記物，因此，用來分離、鑑定細胞的流式細胞儀有被稱為螢光激活細胞分類儀，是分離和鑑定細胞群及亞群的一種強而有力的應用工具。


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