流式細胞儀的那些事兒

　　流式細胞儀在生命科學領域尤其醫學中應用非常廣泛，是一種能夠對細胞進行相關處理的儀器，並且能夠對細胞進行必要的分析。小編為大家介紹一下流式細胞儀的概念、發展歷史、特點、分類、基本原理以及應用。

　　流式細胞術與流式細胞儀的概念

　　流式細胞術(flow cytometry , FCM)：是一種定量分析技術，是指利用流式細胞儀檢測細胞特異性標記螢光信號而測定細胞的多種生物物理性質的方法，同時也是一項可以把具有某相同螢光信號特性的某些細胞亞群從多細胞群體中分離和富集出來的細胞分析技術。

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　　流式細胞儀(flow cytometer)：是一種集雷射技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞螢光化學技術和抗原抗體檢測技術為一體的新型高科技儀器;是以雷射為光源、檢測生物學顆粒理化性質的儀器。

　　流式細胞儀的發展歷史

　　1、1934年，Moldavan使懸浮的紅細胞從一個毛細玻璃管中流過，每個通過的細胞可被一個光電裝置記錄下來。這就是流式細胞儀的雛形。

　　2、1965年，Kamentsky用紫外吸收和可見光散射兩個參數同時測量未染色細胞，給出細胞中核酸的含量和細胞大小。奠定了多參數流式細胞測量的基礎。

　　3、1967年，Van Dilla和Los Alamos採用了層流流動室和氬雷射器，開發出了液流束、照明光軸、檢測系統三者相互垂直的流式細胞儀。這成為目前各種流式細胞儀的基礎。

　　4、1969年，Fulwyler利用靜電墨水噴射液滴偏轉技術，建立了流式細胞分選術。Ehrlich和Wheeless利用飛點掃描技術和縫掃描技術使零解析度的流式細胞儀變成了低解析度的流式細胞儀。

　　5、20世紀70年代，隨著Kohler和Milstein成功提出了單克隆抗體技術和螢光標記技術，為特異研究和分析細胞奠定了良好的基礎。

　　6、1973年，美國BD公司和美國史丹福大學合作，研製開發並生產了世界上第一臺商用流式細胞儀FACS I。

　　7、20世紀80年代，流式細胞儀的數據採集、存儲、顯示、分析日趨完善，隨著樣品製備方法的增加，新的螢光染料和細胞標記物的出現，使流式細胞儀的應用範圍逐漸擴大。

　　8、20世紀90年代，與之配套的標本製備儀和自動進樣器的問世，以及適合臨床應用的單克隆抗體的增加，使流式細胞儀逐漸從科研單位進入醫院的中心實驗室和檢驗科，成為現代化的臨床檢驗儀器的一部分。

　　流式細胞儀的特點

　　1、高速度：每秒可檢測1 000-5 000個細胞。

　　2、高靈敏度：每個細胞只要帶有1 000-3 000個螢光分子就能檢出，兩個細胞之間有5%的差別就可區分出來，光散射的靈敏度為0.3um。

　　3、高精度：在細胞懸液中測量細胞，比其他分析技術的變異係數更小，解析度高。

　　4、高純度：分選細胞的純度可大於99%以上。

　　5、多參數：可同時定量檢測單個細胞的DNA等多個參數。

　　流式細胞儀的分類

　　1、根據功能不同，可分為臨床型和綜合型(科研型)。

　　2、根據有無細胞分選功能，可分為流式細胞分析分選儀和流式細胞分析儀。

　　3、根據結構不同，可分為一般流式細胞儀(零解析度流式細胞儀)和狹縫掃描流式細胞儀(高解析度流式細胞儀)。前者的雷射光斑為橢圓形，光斑直徑大於被檢細胞體積。後者雷射光束為一條線狀扁平光斑，直徑在3-5um。

　　流式細胞儀的基本原理

　　1、將懸浮分散的單細胞懸液，經特異性螢光染料染色後，放入樣品管。

　　2、在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細胞懸液形成樣品流垂直進入流式細胞儀的流動室，流動室充滿鞘液，在鞘液的約束下，細胞排列成單列由流動室的噴嘴噴出，成為細胞液柱。

　　3、液柱與水平方向的入射雷射束垂直相交，相交點稱為測量區。通過測量區的細胞受雷射照射後發出螢光，同時產生光散射。這些信號分別被成90℃角方向放置的光電倍增螢光檢測器和前向角放置的光電二極體檢測器接收，經過轉換器轉換為電子信號。

　　4、電子信號經模/數轉換輸入計算機。計算機通過相應的軟體儲存、計算、分析，就可以得到細胞的大小和活性、核酸含量等理化指標。

　　流式細胞儀的應用

　　1、DNA倍體分析

　　DNA分析是流式細胞儀最初且是現在應用最廣檢測項目。由於惡性細胞DNA含量通常與正常細胞不同，存在異倍體細胞，所以現有很研究評價異倍體細胞與腫瘤惡性度及其預後的關係。DNA含量檢測還可提供細胞周期方面的信息，這在細胞生物學中運用很廣泛。特別地，它可表示出細胞毒性藥物對細胞作用過程。這些DNA檢測還可與細胞表面標誌物標記同時進行，這樣在細胞混合培養中，可通常追蹤表達特異標誌物的細胞顯示其生長周期情況。所有方法都是基於染料能與核酸起特異的化學反應並發射出螢光，常用的染料為PI，DAPI。

　　在該領域Partec公司的 CyFlow PA是一枝獨秀。

　　2、細胞生存能力實驗

　　使用Heochest 33342染料與DNA特異性結合，後因細胞活力不同染料的結合程度也各異，故可評估細胞的活性度。

　　3、計數外周血中檢測網織紅細胞

　　使用TO染料能夠特異性地與RNA結合，結合係數高達3000，故具有很好的性價比。

　　4、外周血、骨髓採集物中CD34陽性幹細胞計數，臨床上用於骨髓移植前幹細胞數理的測定。使用標準ISHAG方案，需要DNA或其他核染料佔用FITC通道，PE標記CD34抗體，PE-CY5標記CD45抗體。

　　5、交叉淋巴細胞、粒細胞毒實驗

　　檢測識別供體血清中免疫球蛋白與受體粒細胞之間是否存在反應有著重要臨床意義，因為這種反應會導致移植後發熱、移植後肺損傷及免疫性粒細胞缺乏症。流式細胞儀可檢測全血樣本與血清孵育後粒細胞上結合的人免疫球蛋白。FITC標記人免疫球蛋白抗體、PE標記粒細胞表面標誌物、PE-CY5標記HLA抗體。

　　6、血小板自身抗體檢測

　　血小板自身抗體識別人血小板抗原，會引起各種臨床相關症狀，如新生兒自免性血小板減少症、輸血後紫癜、難治性血小板減少。流式細胞可快速準確地檢測血小板自身抗體。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別血小板抗體。

　　7、移植交叉配型

　　原細胞毒實驗，主要用於避免移植物超急性排拆反應。流式細胞儀用於監測T或B細胞是否受到受體血清中免疫球蛋白攻擊，作為HLA配型前的預實驗。流式細胞儀因其高精確性已成為該領域內的金標準。FITC標記抗人免疫球蛋白抗體、PE標記識別T細胞CD3或B細胞CD29抗體。

　　8、檢測細胞經抗原或細胞有絲分裂刺激後活化效應淋巴細胞早期活化指標CD69可用來檢測免疫治療效果。流式細胞使用三色分析可監測淋巴細胞各亞群活化情況：FITC標記的CD3抗體、PE標記的CD8抗體、PE-CY5標記的CD69抗體。

　　9、細胞增殖狀態檢測

　　核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量細胞增殖分裂狀況，在評估腫瘤預後有重要意義。為些標誌物的檢測一般同細胞表面標誌物同時檢測。FITC標記PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或(並)PE-CY5標記細胞表面標誌物。

　　10、染色體分析

　　流式細胞儀染色分析運用兩種特異性染料：Hoechest33258與核苷酸AT結合;Chromomycin A3與GC相結合。從而在雙參數坐標上根據染色體ATCG含量的不同識別各種染色體。平時進行的染色體分析耗時且需要操作者極具經驗，而用流式細胞儀時可快速地識別出異常染色體，如加配分選系統可將這些異常染色體分選出來作進一步分析。

　　以上，就是小編為您介紹的流式細胞儀的概念、發展歷史、特點、分類、基本原理以及應用。如今醫療的進步離不開醫療設備的發展與進步，流式細胞儀就是集中於測量發育異常的細胞遺傳物質的數量變化，該設備的鑑定對種質資源、物種進化、物種分類、生態學研究、倍體育種等方面具有重要意義。