淺談流式細胞儀十大發展趨勢

從二十世紀八十年代至今，世界上生產流式細胞儀的廠家幾經變遷，BC & BD仍在，新玩家不斷進入，併購重組各取所需，它們生產各種不同性能和功能的流式細胞儀。總體而言，呈現出以下的發展趨勢：

　　1. 應用對象從細胞到顆粒

　　一般而言，流式細胞儀檢測的對象是細胞，而且是呈獨立狀態的懸浮於液體中的細胞，即單細胞懸液。組織和器官中的細胞，必須用各種方法製備成單細胞懸液，才能進行檢測。

　　細菌、浮遊生物等也可以用流式細胞儀分析。

　　一些不是細胞的單個粒子，如病毒、細胞核、染色體、原生質體等也是流式細胞儀的檢測對象。實際上，用「顆粒」而不僅僅是「細胞」來定義流式細胞儀的檢測對象，顯然更有代表意義。

　　因為流式細胞儀可以將「顆粒」視同為「細胞」來進行檢測，在特製的微球上包被抗原，抗體或核酸探針，以微球為載體來檢測各種可溶性蛋白、細胞因子、自身抗體、特定的核酸序列等，從而使流式細胞儀的檢測對象擴展到分子範圍。

　　Luminex公司的多重流式檢測平臺能夠自一個微量反應孔中同時檢測50、100甚至多達500種分析物，儼然成為這一技術的金標準。

　　2. 檢測顆粒尺度大大拓寬

　　常規流式細胞儀檢測顆粒的範圍為0.5-50μm。

　　電荷分選流式細胞儀檢測顆粒範圍與噴嘴直徑等相關，最大應到噴嘴直徑的1/3-1/2，目前最大直徑的噴嘴為200μm。

　　Union Biometrica公司的氣流分選平臺COPAS FP和BioSorter能夠適應大到1500μm的顆粒，可以用於分選模式動物的卵和幼蟲;模式植物種子與花粉;大體積細胞與細胞簇等。CytoBuoy公司的Cytosense也可以到1500μm。　　

Union Biometrica公司氣流分選流式原理圖

　　通過光路優化，採用多角度光散射，使用特殊螢光探針，甚至加裝紫色雷射收集散射光信號，有些流式細胞儀可以實現0.2μm顆粒與噪音信號的鑑別。

　　Apogee著力於微顆粒分析，其A50-Micro plus散射光的檢測低限至80nm，可用於循環微粒，外泌體及特殊微生物檢測。

Apogee A50-Micro plus

　　3.多種流路技術商品化

　　絕大多數流式細胞儀基於鞘液流體動力學模式。

　　因為負壓進樣省去了龐大的壓縮氣源，可以靈活使用各種上樣管，已經成為幾乎所有公司新儀器的選擇。

　　一般認為，流式細胞儀採用毛細管而非鞘液，容易被大的細胞或聚集細胞所阻塞，而且流動細胞難以準確聚焦，流速難以維持恆定。

　　Guava平臺easyCyte(現被Luminex公司收購)通過負壓進樣，採用高壓注射泵與PEEK管路，建立自穩流的微毛細管系統，據稱解決了以上困擾，帶來的好處是無需鞘液，產生廢液也少。

Guava easyCyte(Luminex)

　　Thermo公司聲波流式細胞儀Attune NxT ，該產品利用超聲波將細胞聚集在樣品流中軸線上。進樣速度至1mL/min時，也可以避免基於鞘液的流式的所謂軸流加寬和細胞分散現象，這一技術的最大優勢是快速檢測，同時對稀有細胞的分析比較有利。

Thermo Attune NxT

　　4.從相對計數到直接絕對計數

　　為滿足統計學要求，流式細胞儀必須採集一定數量的細胞，儀器設定以細胞數為停止條件。傳統流式細胞儀測試結果為相對計數，即目標細胞在某一總體系中的比值。

　　隨著應用深入，人們發現比值的變或者不變，以及變化大小不能反映細胞的真實變化，絕對計數，即單位體積內的細胞數被證明更具實際價值。

　　最早是採用雙平臺法來解決以上問題，即用血細胞分析儀來獲得白細胞，淋巴細胞等濃度，再結合流式細胞儀測定的百分比來計算被測細胞的絕對計數值。由於該法需要使用兩種儀器，操作步驟多、變異係數大，不同實驗室之間的差異也較大，因此應用受到限制。

　　後來人們採用微球法，即用已知濃度的微球作為參比，通過被測細胞和微球的比例關係來進行絕對計數，但因計數微球價格較為昂貴，實際應用受到限制。

　　近年來，廠家的共識回到了測定進樣體積這一思路上來，替代微球法直接進行絕對計數，取得更為精確的結果。區別在於不同產品具體測定技術的差別。

　　蠕動泵：Accuri C6 Plus、CytoFlex

　　注射泵：easyCyte、NovoCyte、CytoFlow

　　流量傳感器：FACSVerse、Bricyte E6

Sysmex CytoFlow系列TVAC體積測定原理

　　5.光路優化和光學新元件的應用

　　龐大的水冷或氣冷的雷射器逐漸被小型化的固態雷射器取代。

　　光纖傳導應用越來越普遍。

　　光纖耦合讓光能量傳輸更高效，而不為公司所專有。

　　雪崩光電二極體等等新檢測器提供新的選擇。請見專家分析：

　　流式細胞儀是怎麼「看見」光的?

　　以及光學元件的神級組合讓靈敏度達到新的高度。

　　MESF是儀器靈敏度衡量的標準，基於微球，基於鞘液。

　　不同公司沒有約定俗成，不是那麼容易比較，但就同一公司產品而言：

　　BD FACSCelesta FITC 25 PE 15

　　Beckman Coulter CytoFlex FITC 30 PE 10

　　6.以多色分析為核心的新型光學技術的迅速發展

　　早期流式細胞儀的主要應用還是細胞DNA含量測定，這一技術對設備要求不高，通常配備一個散射光和一個螢光信號的流式細胞儀就足以應付。隨著新型螢光探針的不斷開發和儀器軟、硬體的逐步更新，流式細胞儀多色螢光分析得到了迅速發展，包括兩個方面：

　　單雷射多色，如488nm雷射同時激發7色，紫色雷射同時激發10色

　　多雷射：如10雷射機器。

　　也包括兩種新的光學設計機型：

　　光譜流式，利用特殊的接受裝置收集某範圍內的全發射光譜，無需補償，區別發射光譜重合度高的螢光染料對。目前有Sony公司SP6800Z和SA3800，Cytek公司的Aurora。

　　質譜流式，利用質譜原理對單細胞進行多參數檢測的流式技術。這個名為CyTOF的平臺最初由DVS Sciences公司開發，後被Fluidigm公司收購。儀器採用同位素標記抗體來標記或識別細胞表面和內部的信號分子，並根據流式細胞原理分離單個細胞，再用感應耦合等離子質譜(ICP-MS)觀察單個細胞的原子質量譜，最後將原子質量譜的數據轉換為細胞表面和內部的信號分子數據。2015年推出的Helios的檢測通道達到135個，幾乎沒有信號重疊或背景噪音。

　　

來自CyTek網站，不代表本人觀念

　　必須注意的是，多色分析提供了多種細胞特性的相互關係圖，從而更加精確地界定一種細胞亞群，更好地對不同細胞進行分類。但是，同時檢測的螢光染料越多，需準確調節各通道之間的補償，技術難度更大，因為其中包含的信息量非常大，錯誤信號摻雜的概率也相應增加，所以數據分析時需格外注意，一般需採用不同的標記方案多次相互驗證才能得出重要結論。光譜流式和質譜流式的出現克服了補償問題。

　　但是，螢光染料匹配仍未解決，畢竟不是每個雷射器都能如設計所願，同時激發6色，7色到10色，甚至如光譜流式所希望的16色或者32色。所以，對20色以上多色分析儀器來說，標稱往往都是理論，至少在目前還是設計師的想像。

　　7.數據處理能力不斷提升

　　隨著數位化技術的引入，以及數據處理系統的升級，流式細胞儀的數據處理能力得到極大提升。

　　數據處理速度：反映數據掃描頻率，用Hz表示。

　　處理精度：信號採集精度，用比特表示，反映採集通道多少。目前儀器一般在20比特(2的20次方，100萬通道)以上，最高達32比特(43億通道)。

　　線性範圍：目前一般在105以上，最高到107。

　　單文件存儲能力：反映文件儲存能力，對稀有細胞分析有利。

　　數據能力的提升直接影響到儀器的分析和分選速度。

　　速度的提升是光路，流路和數據採集系統三者共同優化改善的結果。

　　傳統的流式細胞儀，分析速度不超過10000 events/s，新上市產品基本達到25000 events/s(注意：不是細胞/s)以上，如Beckman Coulter公司CytoFlex為30000 events/s，Cytek公司Aurora 為35000 events/s ，BD公司的LSRFortessa 為40000 events/s with beads，Bio-Rad公司ZE5為100000 events/s。

　　

Bio-Rad ZE5

　　BD公司FACSCalibur的機械分選，速度只有300/秒，對少量細胞收集困難，須配用濃縮系統進行細胞回收;捕獲管的移動和濃縮系統對細胞的機械損傷大，影響分選目的細胞功能特性;由於捕捉器移動不可避免地影響到流路穩定，造成不確定性;機械裝置較難徹底清洗消毒。機械式分選已被速度更高的電荷分選所完全取代。

　　如BD公司FACSAria III(70 psi /90 kHz)和InFlux(60 psi /100 kHz) 四路分選，純度>98%，得率>80%, 分選速度25000 events/s，繼續提高分選速度，純度不受影響，得率會按Poisson分布下降。

　　Beckman Coulter公司的MoFlo XDP和MoFlo Astrios EQ，據稱有效分選速度達到70000細胞/s。

　　8.儀器不斷小型化到微流控

　　追求小型化，幾乎是所有流式製造商開發新產品的共識。

　　看一組數字：主機W x D x H

　　BD Accuri C6 plus / FACSVia

　　37.5 x 41.9 x 27.9 cm

　　BD FACSVerse / FACSlyric

　　63.2 x 57.9 x 57.9 cm

　　BD FACSCelesta

　　58 x 61 x 59 cm

　　Beckman Coulter CytoFlex

　　42.5 x 42.5 x 34 cm

　　Miltenyi Biotec MACSQuant

　　60 x 35 x 40 cm

　　Thermo Attune NxT

　　58 x 43 x 40 cm

　　Cytek Aurora

　　54 x 52 x 52 cm

　　Mindray BriCyte E6

　　50 x 55 x 50 cm

　　「小」意味著節省空間，容易安裝和轉移，「小」更值得期許的是減少樣本體積，降低試劑消耗，提高檢測速度，以及縮小空間所帶來的光電及液路的改善。

　　微流控技術興起於上世紀90年代，顧名思義就是使用微通道(尺寸為數十到數百微米)處理或操縱微小流體。

　　On-chip公司於2012年推出了世界上第一臺微流控晶片流式On-Chip Sort，以低壓對細胞進行分選，降低對細胞的損傷;簡化實驗操作;容易實現系統的無菌;使用一次性交換型模塊，減少樣品間交叉汙染;無需清洗流路通道。Miltenyi Biotec公司的MACSQuant Tyro、Namocell公司的Namocell等亦先後推出類似的微流控流式分選產品。

on-chip公司之on-chip sort

　　Sony公司分選平臺的兩大核心技術即為所謂的CoreFinder全自動校準技術和可更換式微流體晶片的液路設計。最新型號MA900，全自動光路及液流校準;立體式雙光斑四雷射激發，最多同時檢測12色螢光;四路分選。

　　

Sony MA900

　　專門生產分析型微流控流式的製造商Handyem公司，針對微流控裝置容易導致細胞黏附和堵塞的問題，於2015年推出HPC-150(國內品牌深圳芯凱瑞)，採用雙高精度玻璃注射泵代替蠕動泵或單注射泵，據稱克服了上一代產品易見的流路堵塞沉積等問題。

　　9.融合顯微成像技術和流式細胞術

　　細胞生物學兩大技術平臺分別基於顯微鏡和流式，前者以形態分析為優，可提供詳細的細胞圖像信息，但解釋主觀、費時費力;後者以統計學見長，卻缺乏成像能力，因此無法了解亞細胞定位。

　　融合顯微成像技術和流式細胞術的圖像流式細胞儀，以Amnis平臺為代表(現被Luminex公司收購)，最新型號ImageStreamX Mark II，從細胞經過流動池開始即按線性分拆進行分線性照相，其冷CCD採用時間延遲積分方式進行信號採集，每一個樣本的分析都生成該樣本中所有細胞的螢光強度測量參數和圖像資料庫，包括「每個細胞」的明場、暗場以及螢光圖像。

　　對於微弱螢光信號可以通過明視野細胞圖像輔助設定遮罩，特定加強遮罩下細胞螢光信號，實現對微弱螢光圖像的捕捉和分析。

　　系統可以對每個細胞分析超過500種量化參數，包括細胞整體的散射光和螢光信號強度，以及對細胞形態，細胞結構及亞細胞信號分布的分析。

　　圖像流式細胞儀無須為了得到細胞群統計學資料而損失豐富的形態信息，也無須為了獲得細胞細節而損失統計學功能。

Amnis圖像流式細胞儀ImageStreamX Mark II

　　Sysmex公司最近推出MI-1000，自動檢測多達10000細胞的圖像螢光。

　　Union Biometrica公司的氣流分選平臺COPAS VISION也加入了明場圖像。

　　10.專業化和臨床型儀器紛紛面世

　　CytoBuoy公司生產多種用於水體微型生物分析的流式細胞儀，如CytoBuoy安放在浮標上;CytoSub具有特殊的耐壓裝置，以及內部鞘液循環處理裝置，不需外部加入鞘液，可在水下200米使用。Bentley Instruments 公司和Delta Instruments 公司公司專門提供牛奶場使用的專項檢測儀器。

　　臨床市場是商品流式細胞儀最具潛力的發展方向。但是，診斷流式試劑的研發和報證，以及符合檢驗流程的儀器開發，與不斷增長的臨床應用需求並不匹配。

　　一些公司推出了專門的小型流式細胞儀，用於CD4細胞的快速計數，如FACSCount、CyFlow Counter等。

　　邁瑞公司面向臨床用戶工作流程和場景推出BriCyte E6，針對淋巴細胞亞群分群等臨床常規分析，可以實現檢驗儀器常有的一鍵得結果，免去繁複的電壓和補償調整，其LIS的雙向通信，數據管理都非常符合臨床診斷的期望。類似思路在後來上市的BD公司FACSlyric也有體現。

　　老牌血球生產廠商Sysmex 在收購Partec後的第五年，推出了PS-10流式樣本前處理系統，配合新款流式XF-1600，實現樣本處理、離心和檢測的全自動化流程。詳情請見：

　　全自動流式檢測時代的來臨!

　　可以期待，流式細胞儀未來將會作為一個重要的組成部分被整合到血液細胞分析流水線上，在這個系統中，血液細胞分析儀提供血常規結果和異常報警信息，流式細胞儀則根據這些信息對異常細胞進行不同策略的精細鑑別。

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