流式細胞儀原理及應用

摘　要　流式細胞儀是對細胞進行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學方面的特徵參量，並可以根據預選的參量範圍把指定的細胞亞群從中分選出來。本文介紹流式細胞儀的工作原理以及各部分的功能以及各種應用。 

關鍵詞　流式細胞儀 應用發展 光路系統

前言

流式細胞術（flow cytometry）是20世紀60年代後期開始發展的利用流式細胞儀快速定量分析的物理化學特徵以及這些物理化學特徵精確分選細胞的新技術，主要包括流式分析和流式分選兩個部分［1］。流式細胞儀通過雷射照射液流內細胞後的散射光信號和螢光信號反應細胞的物理化學特徵，如細胞的大小，顆粒度和抗原分子的表達情況等［2］。流式細胞儀的出現和流式細胞術的發展是多學科共同發展的結晶，其中涉及細胞與分子生物學和生物技術，單克隆抗體技術，雷射技術，螢光化學，光電子物理，流體力學，計算機技術等。流式細胞術應用領域極其廣泛，特別是免疫學，臨床醫學［3-6］，現在流式細胞術還能夠輔助多種疾病的這段，尤其是白血病的診斷和分型。

基本概念

流式細胞儀，樣品細胞和螢光染料是流式細胞術的三大要素，流式細胞儀根據功能的不同分為分析型流式細胞儀和分選型流式細胞儀，前者只能流式分析，而後者能夠同時進行流式分析和分選目標細胞。流式細胞術檢測的對象是呈獨立狀態懸浮於液體中的細胞，不能直接檢測組織塊中的細胞，必須先用各種方法將臟器或者組織製備成為單細胞懸液，然後標記上螢光素偶聯抗體，才能夠被流式細胞儀檢測；流式細胞術可以定量檢測樣品細胞的物理化學特徵，其定量是以光信號為基礎的，通過分析接收到的雷射照射到細胞後的散射光信號和螢光信號完成定量分析。樣品細胞只有標記螢光染料或者螢光偶聯抗體進而被特定波長照射後才發射特定波長的螢光信號。流式細胞術的指示系統是光信號，接收到的光信號主要有散射光信號和螢光信號兩種，散射光的波長與雷射的波長相同，螢光信號是細胞上結合的螢光素被雷射激發後產生的，一般螢光信號的長要長於激發它的雷射的波長。流式細胞術通過分析散射光信號來反應細胞大小和顆粒度等物理特徵，通過分析螢光信號來反應細胞表達抗原，合成細胞因子等化學特徵。

流式細胞儀的基本組成

各種型號的流式細胞儀雖然差別較大，但是基本結構是相同的，一般分為:液流系統，光路系統，檢測系統和分選系統［7］。分析型流式細胞儀主要由前面的三個系統組成，分選型流式細胞儀比分析型細胞儀多了一個分選系統。

圖1 流式細胞儀液流系統

液流系統由兩套緊密聯繫而又相互獨立的液流組成，即鞘液流和樣品流。鞘液流從鞘液筒開始，通過管道進入噴嘴，經噴嘴的小孔形成穩定的可見的液流。鞘液最基本的特徵就是等滲，保證處於鞘液中的細胞不會因為低滲或者高滲而死亡。樣品流是上樣分析的含有樣品細胞的液體流，樣品流開始於樣品管，經過特定的專門管道進入噴嘴，然後與鞘液一起從噴嘴口射出形成可見液流，最後經過廢液孔流入廢液桶。上樣分析時，兩種液體雖然互相接觸，卻沒有互相混合在一起，而是形成層流，樣品流在中間，鞘液流在外圍，而且兩者所受的壓力也不一樣。操作者可以通過調節樣品正壓和鞘液正壓之差來控制上樣的速度，樣品的正壓和鞘液正壓之差越大，可見液流中樣品流的直徑就越大。上樣分析的速度就越大。

光路系統開始於雷射器，雷射器是流式細胞儀的必需組成元件之一，不同的雷射器發出的雷射照射到細胞之後產生的光信號會經過不同的光路系統被不同的通道接收［8］，流式細胞儀需要通過光路系統，根據不同的接收通道接收，然後通過信號的強弱間接反映細胞的物理化學特性。

光路系統是由一系列的透鏡，濾光片和小孔組成，根據波長的不同分離各種光信號，其中濾光片尤其重要。根據功能的不同，可以分為長通濾片，短通濾片和帶通濾片三種。長通濾片功能為:波長大於特定波長的光可以通過，波長小於該波長的光被反射。短通濾片的波長小於特定波長的光可以通過，波長大於該波長的光被反射。帶通濾片的功能為:波長在某特定範圍的光可以通過，波長在該範圍以外的光被反射。

圖2 488nm雷射側面接收光光信號分離示意圖

利用不同的類型的濾光片，將混合光信號分為六個不同的光信號，進入不同的六個通道，分別為SSC通道，FIFC通道，PE通道，PE-TxRed通道，PE-Cy5通道和PE-Cy7通道。

流式細胞儀的檢測分析系統就是以通道為單位將細胞的各個通道的光信號匯總分析，最後得出的樣品群體中細胞的物理化學特徵。這裡必須提到光電倍增管的概念。通過濾光片根據波長的不同分離的光信號最後進入各自呢通道，也就是各自的光電倍增管。光電倍增管的功能主要為:將光信號轉變為電信號，同時通過一定的比例將信號放大［9］。

流式細胞儀的通道根據光信號性質的不同可以分為散射光和螢光通道。散射光通道是接收散射光的通道，即前向角散射光（FSC）通道和側向角散射光（SSC）通道。螢光通道的命名方式是該通道主要接收哪個螢光素的螢光，就根據該螢光素的名稱來命名。例如FITC通道，接收488nm雷射激發後的螢光信號，波長510-550nm的螢光信號，所以，當細胞被超級FITC偶聯抗體時，該通道所代表的信號就是FITC的信號，該通道接收的螢光信號越強，表示細胞上結合的FITC螢光素越多，為了方便，該通道被命名為FITC通道。此外，以主要螢光素命名的通道並不是只接收這一種螢光素被激發的螢光信號，其他的螢光素被激發後的螢光信號也可以被通道所接收和分析，如FITC通道，它也可以接收GFP和CFSE被488nm雷射激發以後的螢光信號。

散射光信號和螢光信號經過光電倍增轉為電子信號後，是以電子脈衝和電子波的形式被計算機系統接收和分析的。電子波的比較大小主要有三種方式，即電子波的長度，寬度和面積。這三個參數都可以反映光信號的大小，但是參數面積代表電子波的大小要比長度和寬度更加準確。

圖3 流式通道的A，H和W的意義

分選式流式細胞儀比分析型流式細胞儀多一個系統，流式分選系統。分選型流式細胞儀能夠從樣品細胞中分離出目標細胞，回收後可以再培養，即，分選之後的細胞是具有活性的，無菌條件下的細胞。

流式分析的應用

1.免疫表型分析的應用 

檢測淋巴細胞亞群，監測細胞免疫狀態(淋巴細胞是機體免疫系統功能重要的大細胞群，在免疫應答過程中，末梢血淋巴細胞發育分化成為功能不同的亞群。當亞群的數量和功能發生異常時，就能導致機體免疫紊亂並產生病理變化［10-11］。FCM可以同時檢測一種或幾種淋巴細胞表面抗原，將不同的淋巴細胞亞群區分開來，並計算出它們相互間的比例，通過對病人淋巴細胞各亞群數量的測定來監控病人的免疫狀態，並指導治療)。

2. DNA含量及細胞周期分析 

細胞周期分析:在細胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各個時期，DNA的含量隨各時相呈現出周期性的變化［12］。通過核酸染料標記DNA，並由流式細胞儀進行分析，可以得到細胞各個時期的分布狀態，計算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解細胞的周期分布及細胞的增殖活性。也可利用細胞周期蛋白(CYCLIN)、Ki67、核增殖抗原(PCNA)等，對細胞周期進行精確的分期：G0、G1、S、G2、M.應用於：腫瘤的早期診斷、腫瘤的良惡性判斷、觀察細胞的增殖狀態及周期分布和療效監測。  

3.定量分析

檢測細胞特異性標記物：FCM不但可以定性分析標記物，而且可以進行定量。用標記已知數量的螢光素分子的標準微球作參照，可以計算出每個細胞抗原定簇的個數。

參考文獻

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來源：于洋｜圖文

老師：陳德富

編輯：李曉瑩   王雪芹

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指導教師：陳德富

                              

南開大學生命科學學院教授、博士生導師

首屆「談家楨遺傳教育獎」獲得者（2013）

南開大學遺傳學和細胞生物學系主任

南開大學分子遺傳學實驗室PI

南開大學本科生《遺傳學》和《普通生物學》課程負責人

南開大學研究生《現代細胞工程技術》和《分子生物學實驗》課程負責人

天津市科學技術協會委員

天津市生命科學學會聯合體主席團成員、學術諮詢顧問委員會委員

中國遺傳學會理事、科普專業委員會委員

天津市遺傳學會理事長、支部書記

《遺傳》雜誌優秀編委（2016）

主辦單位：陳德富實驗室
承辦單位：2019生物工程班

    

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