Amnis量化成像流式細胞儀在血液學研究中的應用

2020-11-24 儀器信息網

Amnis量化成像流式細胞儀在血液學研究中的應用

 

       白血病是一類造血幹細胞惡性克隆性疾病。克隆性白血病細胞因為增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，並浸潤其他非造血組織和器官，同時抑制正常造血功能。白血病的診斷、分類和預後分層需要綜合運用形態學、免疫表型和遺傳分析方法，而傳統上這需要在多個平臺上進行檢測以便得到最終結果。

 

       成像流式細胞術可以在一個儀器上產生以上所有結果，從而為白血病的診斷和研究開闢了新的工具。基於圖像的流式細胞術結合高解析度數字圖像和標準流式細胞儀所獲得的定量螢光信息，可以確定細胞抗原的定位（即細胞表面、細胞質、細胞核），並且可根據螢光強度、細胞形狀、細胞大小和紋理信息等組合變量選擇特定的細胞群體進行分析，而這是標準流式細胞儀無法實現的特徵。

 

       急性早幼粒細胞白血病（APML）為急性髓細胞白血病的一種特殊類型，急性早幼粒細胞白血病可以通過觀察早幼粒細胞中粒細胞白血病蛋白- PML蛋白的異常彌散分布來進行快速檢測。在正常細胞中，大部分PML蛋白以不連續點狀方式分布在細胞核內，而在APML細胞中PML蛋白會呈彌散性分布。常規檢測方法為顯微鏡觀察，免疫組化，螢光原位雜交以及傳統流式細胞術，但這些方法主觀性很強，靈敏度低。Lizz Grimwade等人[1]嘗試利用Amnis®量化成像流式技術，根據 PML蛋白分布的模式的不同，對正常細胞和APML細胞的PML蛋白分布進行客觀的區分。對病人樣本進行自動檢測，通過統計發生PML蛋白聚集的細胞比率來評估 APML發病的風險。結果表明，Amnis量化成像流式技術能夠分析大量樣本，確定PML蛋白的分布形式，從而找到潛在的異常細胞，增加了檢測的靈敏度和準確率。

圖1. 急性早幼粒細胞白血病(APML)免疫螢光顯微鏡染色顯示(A)在非APML患者中聚集的PML小體和(B) APML患者中彌散性PML小體 (紅色，羅丹明抗PML；藍色，DAPI核染色)。Modulation紋理分析分別顯示在非APML病例(C)和(D)在APML病例中的結果。(E)和(F)分別顯示非APML患者FITC標記的PML聚集體和APML患者彌散性PML。(G) 顯示非APML患者和APML患者之間彌散染色的細胞百分比差異。


       慢性淋巴細胞白血病(CLL)是最常見的白血病，其特徵表型和預後在很大程度上取決於是否存在細胞遺傳學畸變。檢測這些細胞遺傳學異常的金標準是在載玻片上的細胞塗片或組織切片上進行螢光原位雜交(FISH)。螢光原位雜交(FISH)是一種顯微鏡技術，使用螢光探針檢測DNA序列，通常在載玻片上完整細胞的中期細胞塗片或間期細胞核上進行。來自澳大利亞的科學家Henry Hui等[2]展示了使用自動、高通量的Amnis量化成像流式細胞儀評估數千個細胞懸液中CLL細胞染色體的特異性FISH探針信號。成像流式細胞儀的EDF景深擴展能力使FISH探針信號能夠被解析並定位在免疫表型細胞的（染色的）細胞核內。多色流式細胞術免疫表型分析最常用於診斷白血病，因為CLL細胞具有特徵性表型，它們是成熟B淋巴細胞（CD19、CD20陽性），特徵為共表達CD5和CD23抗原。CLL還表現為異質性遺傳不穩定性。超過80%的病例預先存在細胞遺傳學畸變，最常見的是11q、13q或17p缺失和12三體（15%的病例），這些可用於將患者分為高、中、低和極低預後風險類別。圖2展示利用Amnis成像流式進行12號染色體三體CLL細胞的分析方法。使用Amnis ImageStreamX Mk II平臺在血液樣品上開發的自動化「immuno-flowFISH」方法在CLL中評估12號染色體的臨床方法可能應用於疾病分層的診斷和後續治療以評估疾病預後。這些應用將幫助臨床醫生優化治療決策，從而改善患者的治療效果。

 圖2. Amnis成像流式細胞儀進行12號染色體三體CLL細胞的分析方法。(A)分別根據明場圖像的清晰度、面積、寬長比等參數對聚焦細胞進行識別。(B)細胞通過SYTOX AADvanced螢光強度(Intensity_MC_Ch05)進一步鑑定有核細胞，排除增殖細胞或緊密重疊的細胞。(C)和(D)根據CD19-BV480 (Ch07)、CD3-AF647 (Ch11)和CD5-BB515 (Ch02)表達差異對細胞進行分群，分為T細胞(CD3+CD5+CD19-), B細胞(CD3-CD5-CD19+)和CLL細胞(CD3-CD5+CD19+)。(E-G)對每個細胞亞群在CEP12-SpectrumOrange探針(Ch03)通道進行FISH小點計數的結果。(H)可在圖像庫中查看細胞免疫表型或FISH小點計數的亞群，以確認定量分析。259細胞為CD19-BV480陰性，CD3-AF647陽性，CD5-BB515陽性，12號染色體正常T細胞；細胞4419是一個CD19+CD3-CD5-12號染色體正常B細胞；細胞7805是一個CD19+CD3-CD5-12號染色體三體CLL細胞；細胞1851是一個CD19+CD3-CD5+12號染色體正常B細胞；和細胞1828是一個CD19+CD3-CD5+12號染色體三體CLL細胞。

 

       Amnis量化成像流式細胞儀可以讓科學研究更加生動，富有樂趣，其高靈敏度的檢測和成像分析的大數據則讓文章充滿亮點，是您科學研究的好幫手。

  

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       利用傳統流式細胞檢測技術，研究人員可以分析成千上萬個細胞，獲得每個細胞的散射光信號和螢光信號，從而得到細胞群體的各種統計數據，但是傳統流式細胞檢測技術獲得的細胞信息相對有限。細胞對研究人員來說，只是散點圖上的一個點，而不是真實的細胞圖像，缺乏細胞形態學、細胞結構及亞細胞水平信號分布的相關信息。要想獲得細胞圖像，研究人員就必須使用顯微鏡進行觀察，但顯微鏡能夠觀察的細胞數量是非常有限的，很難提供細胞群體的量化與統計數據。Luminex公司Amnis®量化成像流式技術開創性地將流式細胞技術與螢光顯微成像技術結合於一體，在傳統流式抽象的統計學數據基礎上，既能提供細胞群的統計數據，又還可以獲得單個每個單細胞的明場和螢光圖像，從而為研究人員提供了細胞形態學、細胞結構和亞細胞信號分布的完整信息。

 

       Amnis量化成像流式細胞儀具有高達12個檢測通道，可以對通過流動室中的每個細胞進行成像，並對圖像進行多參數量化分析，獲得全新的細胞形態統計學數據。系統配有功能強大的數據分析軟體IDEAS，可以對每個細胞圖像通道分析超過上百種量化參數。這些參數不僅包括細胞整體的散射光和螢光信號強度，還包括對細胞形態，螢光分布、小點計數、螢光共定位等多種信息的分析。隨著Amnis高速顯微成像流式細胞技術的發展成熟，越來越多的科研人員開始將這種革命性的技術手段運用到自身的研究領域，並發表了大量有影響力的論文。

圖3.路明克斯Amnis量化成像流式細胞儀，左為FlowSight®，右為ImageStream®X Mk II

 

 

參考文獻：

 

[1] Grimwade, L., Gudgin, E., Bloxham, D., Scott, M. A., & Erber, W. N. (2010). PML protein analysis using imaging flow cytometry. Journal of Clinical Pathology, 64(5), 447–450. doi:10.1136/jcp.2010.085662 

[2] Hui, H., Fuller, K. A., Chuah, H., Liang, J., Sidiqi, H., Radeski, D., & Erber, W. N. (2018). Imaging flow cytometry to assess chromosomal abnormalities in chronic lymphocytic leukaemia. Methods, 134-135, 32–40. doi:10.1016/j.ymeth.2017.11.003 

 


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