非成像式流式細胞儀的發展與應用

　　引 言

　　流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）也稱為螢光激活細胞分類術（Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS） ，是利用流式細胞儀對處在快速、直線、流動狀態中的單細胞或者生物顆粒進行多參數、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現代細胞分析技術。流式細胞儀（Flow Cytometer）是集雷射技術、光電檢測技術、細胞螢光化學技術、單克隆抗體技術以及計算機技術於一體的新型高科技儀器。它能夠高效檢測細胞大小、粒度、表面積等細胞結構參數和細胞表面 / 胞質 / 核的特異性抗原、細胞內細胞因子、酶活性、Ca2+、細胞活性等細胞功能參數， 同時還具有細胞分選和計數能力。自上世紀70年代第一臺流式細胞儀問世以來，歷經 40 多年的迅猛發展，目前流式細胞儀已經廣泛應用於生物學、藥理學、免疫學、血液學、腫瘤學以及細胞凋亡檢測和臨床檢驗等領域。

　　1  流式細胞儀的結構

　　流式細胞儀主要由液流系統、光學系統、電子系統和細胞分選系統 4 部分組成。經過特定螢光染色的待測樣本細胞懸液，在鞘流的包圍約束下，細胞成單列排布，由流動室噴嘴高速噴出，形成細胞液柱。液柱與雷射束垂直相交，相交位置即為檢測區，在入射雷射照射下產生螢光信號和前向散射光信號（FSC，Forward Scatter）與90°側向散射光信號（SSC，Side Scatter） ，可被電子系統檢測並輸入到計算機利用專業軟體進行細胞多參數分析與分選。

　　1.1  液流系統

　　液流系統主要負責將待測樣品從樣品室運送到流動室的測量區域，其理想狀態是把細胞傳送到雷射束的中心，並且在一次曝光時間內，只允許一個細胞通過雷射束，然後根據需要，液流流入廢液桶或者分選收集管。液流系統主要由流動室和液流驅動系統構成。流動室內充滿鞘液，根據層流原理，在鞘液的包圍下，細胞排成單列從流動室的噴嘴流出，並且被鞘液包圍形成細胞液柱。另外，同軸流動的設計，使得樣品流（核流）和鞘流始終保持分層鞘流的狀態。

　　1.2  光學系統

　　光學系統負責產生並採集螢光、散射光信號，主要由包括雷射、光纖、光束形成稜鏡、聚焦鏡的光學激發系統和包括螢光物鏡、光纖、光學濾片、檢測器的光學採集系統組成。目前流式細胞儀廣泛使用的是 488nm 的氬離子雷射器和 635nm 的氦 - 氖雷射器。光學濾光片放置在光電倍增管前面，對去除幹擾信號、提高結果的準確性至關重要。

　　1.3  電子系統

　　電子系統的功能是將螢光和散射光信號轉換成電信號， 並進行數位化處理後送入計算機用專用軟體進行分析，包括光電轉化器、信號放大器、信號處理系統和計算機軟體分析系統。液柱中的細胞經過測量區域被雷射照射，產生螢光信號和前向角散射與 90°側向角散射信號。其中螢光信號由光電倍增管檢測，2 個散射光信號由光電二極體檢測。螢光信號與產生螢光的化學物質有關，前向散射光信號與細胞大小有關，90°側向散射光信號與細胞粒度有關。通過安裝多個濾光片和不同波長的雷射器就能得到更多的螢光信號和散射光信號，這對於人們認識細胞內化學物質的相互作用具有十分重要的現實意義。

　　1.4  分選系統

　　利用流動室噴嘴上的高頻壓電晶體的振動，將液流變成只包含單個靶細胞的小液滴，系統根據鞘流的流速與晶體振動的頻率，精確算出小液滴的間距，然後對其施加相應的電壓，當小液滴通過正負極板時就會發生偏轉，流入相應的收集管裡， 不帶電的液滴就會流入中間的廢液桶裡，從而實現對細胞（ 包括中性粒細胞 ） 的分選 　　。

　　2  流式細胞儀的最新進展

　　2.1  光學系統的完善

　　隨著雷射技術的發展，雷射器的性能更加優異，價格也更加低廉，這使得雷射逐漸取代非相干光源，在流式細胞儀中得以廣泛應用。目前，除德國的Partec 等公司的部分產品仍使用汞燈作為光源激發紫外的螢光物質外，多數的流式細胞儀都配備多個雷射器，同時發出不同波長的雷射以激發出多種螢光。例如BD 公司的 FACSAria 流式細胞分選儀除配備較為常用的488nm藍光和640nm紅光外，還配備 407nm 光源。同時，染料雷射器的出現，使得光源發出連續可調的光譜成為可能，極大地擴展波長範圍，可以滿足用戶多種特殊的需求。另外，通過配備多個光學濾光片，可同時檢測多種螢光信號和包括 FSC 和 SSC 在內的信號，豐富人們的視野，更好地實現對細胞的檢測。

　　2.2  靈敏度和解析度的提高

　　靈敏度反映儀器能夠檢測到最弱的螢光和散射光信號，直接決定能否檢測出待檢測指標。靈敏度主要與待檢測物體被雷射照射效率和螢光接收效率有關，靈敏度的高低也是衡量流式細胞儀性能的最重要指標之一 ［4］。通過使用更加貼近最大吸收波長的激發光源和改善光路系統設計能夠有效提高流式細胞儀靈敏度，同時，使用較高靈敏度的光電檢測元件也可以分析微弱的螢光信號，較大程度上提高流式細胞儀靈敏度。目前流式細胞儀多使用石英微流動室 和數值孔徑較大的物鏡，使得收集到的細胞螢光信號顯著增強。另外，通過使用光子計數系統，也能夠實現對一些微弱螢光信號的檢測。光子計數系統具有較高靈敏度，但是檢測面積比較小，使用時應該用高質量的透鏡組將光子匯聚到它的有效面積上。隨著螢光技術的發展，市場上出現更多類型的螢光染料可供選擇，螢光的激發光強也有很大的提高， 實現靈敏度提高。另外， 使用高透射率、高折射率的光纖，也能夠更好地與光源、光電檢測器和晶片耦合，顯著降低光強損失，提高儀器靈敏度。

　　隨著液流系統、光電檢測技術和計算機技術的發展，流式細胞儀的解析度也有顯著提高。目前市場上流式細胞儀的解析度可以達到 1 ∶ 512000，能夠得到 CV 值（變異係數）很小的實驗數據， 徹底改變以往很難把染色體區分開的局面，這使得解析度較高的染色體的分析和分選成為可能。同時，隨著靈敏度和解析度的提高，實驗所需的樣品容量也進一步減少，如 C6 流式細胞儀最小的樣品大小僅為 30µL，這對於難以獲得較大樣品量的研究實驗具有十分重要的意義。