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一、標本製作 可製作塗片、印片、細胞單層培養物、組織切片，經適當固定或不固定，作免疫螢光染色用。
二、螢光抗體染色方法
➤ 直接法
1．染色 切片經固定後，滴加經稀釋至染色效價如1：8或1：16的螢光抗體（如兔抗人γ-球蛋白螢光抗體或兔抗人IgG或IgA螢光抗體等），在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮溼的染色盒內，防止乾燥。
2．洗片 傾去存留的螢光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結晶。
3．用50%緩衝（0.5mol/L碳酸鹽緩衝液pH9.0～9.5）甘油封固、鏡檢
4．對照染色
①正常免螢光血清染色，如上法處理切片，結果應為陰性。
②染色抑制試驗（一步法）：將螢光抗體和未標記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法處理切片。結果應為陰性。為證明此種染色抑制不是由於螢光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標記抗血清，染色結果應為陽性。此法結果較二步法穩定。
③類屬抗原染色試驗，前面已作敘述。 直接法比較簡單，適合做細菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種螢光抗體只能檢查一種相應的抗原，特異性高而敏感性較低。
➤ 間接法
（1）切片固定後用毛細滴管吸取經適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置於染色盒中保持一定的溼度，37℃作用30min。然後用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹乾餘留的液體。 （2）再滴加間接螢光抗體（如兔抗人γ-球蛋白螢光抗體等），同上步驟，染色30min，37℃，緩衝鹽水洗兩次10min，攪拌，緩衝甘油封固，鏡檢。
對照染色：
①抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進行染色，結果應為陰性。
②抗原對照：即類屬抗原染色，亦應為陰性。
③陽性對照。 間接法中上述方法稱雙層法（Double Layer Method）。
另一種稱夾心法，即用未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應抗體結合，再用該抗原之螢光抗體重疊結合其上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在，方法步驟如下：
①切片或塗片固定後，置於染色溼盒內。
②滴加未標記的特異性抗原作用切片於37℃，30min。
③緩衝鹽水洗2次，每次5min，吹乾。
④滴加特異性螢光抗體再用切片於37℃，30min。
⑤如③水洗。
⑥緩衝甘油封固，鏡檢。 間接法只需製備一種螢光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易製備動物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查，所以已被廣泛應用於自身抗體和感染病人血清的試驗。
➤ 補體法
1．材料
（1）免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補體螢光抗體等，按下述的補體法染色。免疫血清補體結合的效價，如為1：32則免疫血清應作1：8稀釋。
（2）補體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補體結合反應試管法所測定的結果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩衝鹽水中，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。
（3）抗補體螢光抗體：在免疫血清效價為1：4，補體為2單位的條件下，用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白螢光抗體的染色效價，然後按染色效價1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。
2．方法步驟
（1）塗片或切片固定。
（2）吸取經適當稀釋之免疫血清及補體之等量混合液（此時免疫血清及補體又都稀釋一倍）滴於切片上，37℃作用30min，置於保持一定溼度的染色盒內。
（3）用緩衝鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸乾標本周圍水液。 （4）滴加經過適當稀釋之抗補體螢光抗體30min，37℃，水洗同（3）。
（5）蒸餾水洗1min，緩衝甘油封固。
3．對照染色
（1）抗原對照。
（2）抗血清對照：用正常兔血清代替免疫血清。
（3）滅活補體對照：將補體經56℃30min處理後，按補體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合後，進行補體法染色。