免疫螢光可以避開的「坑」

總是會看到人家提取的細胞，拍的漂漂亮亮的圖片，在面前晃，然而，輪到自己，發現並不是準備細胞—固定細胞—細胞通透—封閉—上一抗—上二抗-染核-鏡檢這麼簡單，後來發現，不要50個字都可以形容出來的實驗步鄹，卻這麼難。。。

五點建議讓你避開免疫螢光的坑，美美的show一把自己的成果，也對的起因為實驗掉的大把的頭髮了。

1.考慮抗體的建議稀釋度，以實現高的信背比。若抗體濃度過低，則螢光信號較弱，可能難以與背景區分開，但抗體濃度過高，則會導致較高的背景染色。」

2.利用生理溶液來洗滌，可去除未結合的螢光試劑，或那些只是粘在目標上而非特異性結合的螢光試劑，從而提高信背比。

3.螢光物質必須在建議溫度下小心保存，並始終注意避光，以保護其光譜完整性。

4.在設計多重實驗時，應考慮每種螢光基團的獨特性質，如最大吸收波長和最大發射波長，消光係數和斯託克斯位移等因素一定要讓您的試劑和使用的儀器匹配；

5.一定要有對照，原代細胞免疫螢光實驗中，一般建議使用不表達目標的細胞或組織作為陰性對照。而螢光Western blot或ELISA技術中，含有目標抗原的蛋白或肽段適合作為陽性對照。

提取的原代細胞一般都採用免疫螢光檢測細胞幾個主要的marker，以確定細胞的真實性，如Cell Systems的主動脈原代細胞，檢測CD 62E (E-Selectin)，VWF / Factor VIII，Di-I-Ac-LDL三個主要的marker，還進行了出庫的標準測試，無HIV, BPV 和支原體檢測等。

一些常見的坑：

一．信號弱或無信號，染色細胞過少可以考慮以下幾點：

1.目標蛋白在細胞中沒有表達

解決辦法：製備細胞裂解液，用 Western Blo tting 驗證目標蛋白在細胞中是否表達

2.表達目標蛋白的細胞過少

解決辦法：標本中使用更多的細胞，試用其他瞬 時轉染方法，或者使用穩定轉染細胞系

3.細胞通透性差

增加通透劑作用的時間或者濃度，或 改用其它的通透劑

4.染色前的固定步驟破壞了抗原表位

改用其他固定方法

5.抗體問題

抗體不適合，抗體選擇錯誤或者抗體稀釋不標準也會導致無信號，建議按標準稀釋，同一樣品按最佳的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定最佳的一抗稀釋比例，

Cell Systems免疫螢光

二.視野中細胞不細胞之間存在散在的發光點：

答：：1，拍照時 PBS 量過少引起的非特異性；

PBS 未過濾，未溶解的殘渣黏附而導致

三．鏡下觀察只有 DAPI 的藍光，目的螢光幾乎沒有戒者很弱？

出現這種現象很有可能是抗體比例太低，需提高抗體濃度，可配合提高二抗 濃度；共聚焦的激發螢光強度丌夠大；二抗孵育時是否是對應的種屬。

四．細胞核周圍總是存在有一些藍色的小點點？

此種情況一般是支原體汙染所致，建議用殺支原體藥 2 周后再檢測，戒者通 過提高共聚焦機器背景值來覆蓋支原體螢光。