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實驗室裡。。。。。。
師姐：小白，明天我帶你做個免疫螢光實驗吧！
小白：好的，師姐。
小白的內心獨白：免疫螢光是什麼？咱也不敢問，咱也不敢說，還是先上網查查吧
本文將從是什麼，為什麼，怎麼做三部分進行講解。
一、是什麼？
免疫螢光（immunofluorescence，IF）技術是免疫學、生物化學和顯微鏡技術相結合而建立起來的一項新型生物技術。
根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上螢光基團，再用這種螢光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。
利用螢光顯微鏡可以看見螢光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及利用定量技術（比如流式細胞儀）測定含量。
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二、為什麼？
免疫螢光技術廣泛應用於細胞活性、細胞壞死、細胞凋亡、細胞代謝、鐵死亡、細胞自噬、線粒體自噬等。
在臨床上，此項技術用於患者腦神經細胞、口腔細胞、組織等類型細胞的健康檢測。
三、怎麼做？
A、溶液和試劑
若想獲得高質量的免疫螢光圖片，高效且划算的預製試劑。
note：利用反滲透去離子水 (RODI) 或同等級別的水製備溶液。
磷酸鹽緩衝液 (PBS)
甲醛：16%, 無甲醇，使用新鮮製劑，小瓶打開後避光 4°C 保存。按照 1 比 4 的比例在 1X PBS 中稀釋，製成 4% 甲醛溶液。
封閉緩衝液：（1X PBS/5% 正常血清/0.3% Triton ™ X-100）：準備 10 ml 緩衝液，添加 0.5 ml 與二抗同一物種來源的正常血清並混勻。攪拌時加入 30 µl Triton™ X-100。
抗體稀釋緩衝液：(1X PBS/1% BSA/0.3% Triton™ X-100)：準備 10 ml 溶液，添加 30 µl Triton™ X-100 到 10 ml 1X PBS 中。混勻後再加入 0.1g BSA，並混勻。
螢光物質標記二抗：（抗小鼠） （抗兔）（抗大鼠 ）。
Prolong® Gold Antifade Reagent , Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI
B. 標本準備
I. 培養細胞系 (IF-IC)
註：細胞應當在多孔板、腔室玻片或蓋玻片上直接培養、處理、固定和染色。
吸乾液體，隨後在細胞上覆蓋一層 2–3 mm 用溫熱 PBS 稀釋的 4% 甲醛。
註：甲醛有毒性，僅限通風櫥中使用。室溫下固定細胞 15 分鐘。
吸乾固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分鐘。
繼續進行免疫染色操作（C 部分）。
II. 冰凍/低溫切片 (IF-F)
冰凍固定組織進行免疫染色（C 部分）。
對新鮮未固定的冰凍組織，立刻按下列步驟固定：
將切片覆蓋一層用溫熱 1X PBS 稀釋的 4% 甲醛溶液。
室溫下固定切片 15 分鐘。
用 PBS 漂洗玻片三次，每次 5 分鐘。
繼續進行免疫染色操作（C 部分）。
C. 免疫染色
註：所有隨後的孵育都應當在室溫下完成，除非另外註明需要在潮溼光密盒或帶蓋的培養皿/板中孵育，以防止乾燥和螢光物質淬滅。
在封閉緩衝液中封閉標本 60 分鐘。
封閉標本時，按照數據表中推薦的稀釋比例，在抗體稀釋緩衝液中配製一抗。
吸去封閉緩衝液，加入稀釋後的一抗。
4°C 孵育過夜。
用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分鐘。
註：如果使用螢光物質標記的一抗，則跳轉到Ｃ部分，第 8 步。
用抗體稀釋緩衝液將螢光物質標記的二抗稀釋後，室溫下避光孵育標本 1–2 小時。
用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分鐘。
使用 Prolong® Gold Antifade Reagent或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI，用蓋玻片蓋住切片。
要達到最佳效果，使用封片液室溫過夜。將切片平放避光 4°C 環境下，可長期保存。
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參考文獻：https://www.cst-c.com.cn/contents/resources-protocols/immunofluorescence-general-protocol/if