常見螢光蛋白簡介
以GFP為藍本通過基因技術合成的突變體發射光譜涵蓋了整個可見光波段，近幾年針對螢光蛋白的改造工作主要集中於提高螢光蛋白的亮度，改變Stokes位移(指激發峰與發射峰之間的距離)和光譜特性，以及尋找新型光轉換/光激活螢光蛋白等方面開展。下面介紹幾種較為常用的綠色/紅色螢光蛋白基因及發光特性。
mGFP5：將野生型GFP的ser65替換為thr，螢光強度較野生型的GFP提高了4-6倍。GFP的激發光波長與紫外線區較為接近，對光學要求較高，並且對生物有較大的毒害作用，不適宜作活細胞觀察。改造後的mGFP5的激發光波長提高到488nm，位於青色區域，有效避免了上述缺點。目前這一突變體已被EGFP替換。
EGFP：在mGFP5的基礎上將Phe64替換為Leu，得到的GFP突變體命名為EGFP。EGFP的生色團在37℃的螢光得到了很大的提高，螢光強度較野生型GFP提高了35倍，並且在激發後16-24小時後仍可穩定地檢測到。當然，EGFP也有相應的缺陷，對pH較為敏感，易於二聚化。EGFP目前仍然是最常用的綠色螢光蛋白。
D2EGFP：在EGFP的C端加入422-461胺基酸殘基的小鼠鳥氨酸脫羧酶（MODC，mouse ornithine decarboxylase），得到一個不穩定的EGFP變體。MODC的422-461胺基酸殘基區包含一個PEST序列，靶定目的蛋白降解，d2EGFP只有2小時的半衰期。
多色GFP變體：將接近GFP生色團的Thr203突變為Trp後，可以將激發光和發射光的波長均增加20nm，再進一步改造為黃色螢光蛋白EYFP。如果將GFP生色團中的Tyr66突變為His後得到藍色和青色螢光蛋白變體BFP/CFP。這些變體或存在光漂白現象，或螢光強度不高，或對pH變化敏感等缺陷，需要進一步的改進優化。
橙/紅色螢光（560-650nm）可以較好的與共聚焦顯微鏡和寬視場顯微鏡兼容。橙/紅色螢光蛋白對於活體生物成像具有很好的應用前景，機體組織內的血紅素在可見光波段有強吸收，而水與脂肪在紅外波段有強吸收，在近紅外光波段（650-900nm）的吸收係數最小且自發螢光最弱。此外基於其較長的激發光波長，對細胞毒性較小，可以用於檢測較深的組織。最早應用的橙色螢光蛋白是從一種熱帶珊瑚（Discosoma striata）中分離得到的，命名為DsRed。DsRed的激發光主峰值為558nm，次要峰值為500nm附近，螢光發射光波長為583nm。DsRed成熟時間較長，易形成四聚體，阻礙了它的應用。
DsRed2：將DsRed的多肽氨基末端進行突變改造得到的螢光蛋白突變體DsRed2，減少了蛋白凝集作用，降低了細胞毒性，同時螢光蛋白的成熟時間也變短了。DsRed2依然會形成四聚體，由於成熟時間變短，在多色螢光實驗中可以更好地和GFP結合使用。DsRed2相對一代DsRed應用略廣泛。
DsRed-express：在DsRed2基礎上進一步改造得到的，成熟時間進一步變短，螢光強度也得到了增強。DsRed的紅色螢光要在表達後11小時才可以觀察到，DsRed2縮短為6小時，而DsRed-express則只要1小時。遺憾的是，DsRed-express的易聚集為四聚體問題仍未得到解決。
mRFP1：代單體紅色螢光蛋白mRFP1是通過改造DsRed的33個殘基而來，激發光波長為584nm，發射光波長為607nm。同其他螢光蛋白衍生物一樣，mRFP1也表現出明顯的螢光發射減弱和光漂白現象。
mCherry：通過對mRFP1的發色團殘基進行點突變獲得新的螢光蛋白，以相應的水果名字來命名為mCherry，發射峰位於610nm。mCherry成熟快，單體特性好，光穩定性較強，但亮度偏低。
Kaede：從石珊瑚Lobophyllia hemprichii中克隆得到的，其在紫外光照射下，發射能從綠色（518nm）變為紅色（580nm）。Kaede是光轉換蛋白中的一種，具有一個能發出綠色螢光的由三肽His-Tyr-Gly發色團，它的螢光轉換是由於緊鄰發光團H62上的肽鍵發生斷裂而引起的。Kaede在斑馬魚中常用來作為研究細胞運動的標記基因，如標記原腸期的囊胚細胞研究匯聚延伸運動。Kaede易形成四聚體，限制了其在蛋白標記與超分辨成像方面的應用。
螢光蛋白的研究為生命科學提供了不可或缺的研究手段，目前在活體成像深度上仍有待進一步發展，需要不斷改良優化新的亮度高的單體近紅處/紅色螢光蛋白分子。新特性的螢光蛋白，如光轉換與光活化螢光蛋白、大strokes位移的螢光蛋白等的開發也將為光學成像技術帶來新的突破，有效地提高成像的時空解析度和靈敏度。
螢光蛋白標記技術
蛋白標記的主要目的是監測生物過程、輔助檢測（例如化合物的可靠定量、蛋白質修飾的特異性檢測）或者純化標記後的蛋白及其結合對象。蛋白質的標記能夠提高檢測靈敏度以及簡化檢測工作流程。
目前有多種蛋白質標記技術來幫助我們研究感興趣的蛋白質的豐度、位置、相互作用、翻譯後修飾、功能，乃至監測活細胞中的蛋白質運輸等問題。目前有多種類型的標記物和標記方式可供選擇，但是針對特定的應用應當選擇適合的標記策略。
代謝標記策略是一種體內標記方法，在這種方法中，細胞被「餵養」了化學標記的營養物，然後這些標記物被摻入新合成的蛋白質、核酸或代謝物中。然後，我們可以收集細胞並分離這些分子以獲得細胞生物過程的全局視圖。
原理：蛋白同位素標記是一種經典的蛋白示蹤和蛋白組學定量技術，用天然同位素（輕型）或穩定同位素（重型）標記的必需胺基酸取代細胞培養基中相應胺基酸，這樣細胞新合成的蛋白質可以在細胞生長期間通過摻入含有不同同位素的胺基酸進行標記。
原理：如果不具備質譜實驗條件，那麼可以使用基於生物正交反應的代謝標記方法。在生物正交系統中，細胞被「餵食」標記有一些對天然生物反應基團無反應的化學基團的分子結構單元。添加含有該基團的反應配偶體的外源性化合物引發化學反應，將標記的生物分子偶聯至所需的官能團。
自發螢光蛋白、小分子螢光標誌物染料、納米晶體材料（即量子點材料）、小分子蛋白質標籤等等這些材料都可以作為螢光標誌物，結合螢光成像檢測儀器可以對目標蛋白的表達情況、細胞中的定位情況、相互作用、活性狀態等指標進行研究。
若將目的蛋白與螢光蛋白融合，則能夠實現目的蛋白的細胞內觀察，可用於多色標記和螢光共振能量轉移（FRET）應用，用於可視化蛋白質與其他亞細胞結構的易位，研究蛋白質-蛋白質共定位，檢測來自不同啟動子的基因表達的開始，以及混合細胞群的分離。從早期的綠色螢光蛋白GFP發展到現在，我們已經擁有了覆蓋多種光譜區域的螢光蛋白，包括綠色螢光蛋白、藍色和藍綠色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、橙色螢光蛋白、紅色螢光蛋白，不同光譜型的螢光蛋白在亮度、光穩定性、分子大小上有所不同。
螢光染料標記蛋白或多肽技術是常見的蛋白體外標記技術，除了GFP等融合表達螢光蛋白之外，目標蛋白經過螢光染料標記可以直接進行活體示蹤、細胞分選等下遊實驗操作。
原理：螢光標記所依賴的化合物稱為螢光物質。螢光物質是指具有共軛雙鍵體系化學結構的化合物，受到紫外光或藍紫光照射時，可激發成為激發態，當從激發態恢復基態時，發出螢光。蛋白螢光標記技術利用螢光物質共價結合在目標分子的某個基團上，利用它的螢光特性來提供被研究對象的信息。
應用和特點：活化的螢光染料，例如FITC、7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）、羅丹明B（RhodamineB）或AlexaFluor染料等，可用於標記抗體或蛋白功能基團，生成分子探針並通過螢光成像進行檢測。當用螢光染料化學標記特異性抗體或其他純化的生物分子時，它們成為用於檢測靶抗原或相互作用配偶體的螢光探針，應用於細胞成像、流式細胞術、蛋白質印跡和酶聯免疫吸附實驗（ELISA）。因為螢光標記物具有無放射物汙染、操作簡便等優點，使其在蛋白功能研究、藥物篩選等許多研究領域的應用日趨廣泛。
原理：量子點（QuantumDots）是一種無機納米結晶體，它可以根據其大小發出特定波長的螢光，它具有非常高的消光係數，其消光係數要比小分子螢光基團和螢光蛋白高出10~100倍，同時量子點的量子產率也很好。典型的量子點都含有一個CdSe或CdTe核心，外面包裹一硫化鋅（ZnS）外殼。量子點的吸收波長範圍覆蓋從非常短的波長至略低於其發射波長的廣闊範圍，因此一束單波長激發光就可以讓量子點達到多重發射。
應用和特點：目前研究出的水溶性量子點和油溶性量子點可以與抗體、鏈黴親和素等分子進行偶聯，應用於生物標記檢測、高通量編碼、活體成像及動態示蹤等領域。不過結合了生物大分子的水溶性量子點體積較大（直徑約10nm~30nm），從而阻礙了它通過細胞膜結構，因此只能用於經過透化處理的細胞，或者只能對胞外蛋白或可以被細胞內吞的蛋白進行研究。
原理：生物素（Biotin）是蛋白質檢測、純化和固定的有用標籤，因為它可以高親和力地與鏈黴親和素（Avidin）和鏈黴親和素（Streptavidin，SA）結合。生物素-親和素的親和力至少比抗原-抗體結合力高百萬倍，這種相互作用是蛋白質和配體之間最強的非共價相互作用之一。另外，生物素（MW=244.3Da）比酶標記物小得多，因此不太影響蛋白質本身的天然功能。總之，這些特徵使得生物素-親和素策略成為許多檢測和固定應用的理想選擇。
生物素化蛋白質是生物素與蛋白質共價結合的產物，因為生物素化蛋白質同時具備了高親和力、高特異性和高靈敏度的優點，所以它提高了基於免疫方法的檢測、純化蛋白質技術的效率。
應用：生物素-親和素系統廣泛用於流式細胞術、螢光成像、蛋白質印跡和ELISA檢測，以增加信號輸出和更高的靈敏度。親和素或鏈黴親和素的螢光綴合物用於檢測生物素化的生物分子。親和素或鏈黴親和素的酶綴合物，通常用於蛋白質印跡，ELISA和原位雜交成像應用。親和素或鏈黴親和素綴合的磁珠和樹脂可用於分離蛋白質、細胞和DNA，也可用於免疫分析或生物篩檢。
以辣根過氧化物酶（HRP）和鹼性磷脂酶（AP）為代表的酶標記物適用於與蛋白偶聯並為免疫檢測製備抗體偶聯物。這兩種標記物常被用於標記抗體後用作ELISA檢測。
HRP適用於快速顯色反應，ELISA檢測中加入底物後在5~10min內即可到達OD450值1.8~2.5左右，而AP適用於慢速顯色反應，其顯色時間約4~8h，催化形成的黃色化合物比較穩定，比較適合酶促動力學的定量檢測。