▉ 導讀
螢光蛋白是分子生物學研究中的重要工具，在實驗室中，一個普通的本科生經過科研訓練就可以表達發出漂亮螢光的蛋白。儘管科學家們一直對螢光蛋白進行改造來開發出更多的生物學工具，但仍然面臨著許多問題。那麼接下來，我們來一起看一下螢光蛋白的發展歷史吧。
螢光的原理：電子吸收能量從基態躍遷至第一電子激發態，通過內轉化的方式到達第一電子激發態的最低態，之後躍遷至基態，以光的形式釋放能量，產生螢光。由於激發和發射之間能量的損耗，因此，發射波長比激發波長更長。
在許多方面，螢光是一種來監控細胞內信號通路行為的理想工具，主要突出特點有1：螢光快速：螢光團對光的吸收和發射發生在納秒級；2：空間精確：發射波長小於許多細胞結構，是用來成像的優秀工具。
▉ 經典之綠色螢光蛋白
綠色螢光蛋白GFP是第一個被發現的螢光蛋白，來源於水母Aequorea victoria。GFP分子量約為27kDa，是一個由238個胺基酸組成的單鏈多肽。最大激發波長395nm，發射峰509nm，並且在470nm處有一個肩峰。其化學性質穩定，作為螢光標記廣泛應用於生物醫學研究。
其發色團由65至67位的三個胺基酸（Ser-Tyr-Gly）殘基組成，包裹在一個β摺疊形成的桶裝結構中。當蛋白質鏈摺疊時，這段被深埋在蛋白質內部的胺基酸片段經環化，脫水形成咪唑酮。在分子氧存在的條件下，發色團可進一步發生氧化脫氫，最終形成螢光。簡單來講，66位酪氨酸的六元苯環與蛋白質主鏈環化形成的雙環共軛結構可以發光。GFP需要在氧化狀態下產生螢光，強還原劑或者酸性條件能使GFP轉變為非螢光形式，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP螢光便立即得到恢復。只需要氧氣作為底物便可以發光，不需要任何外源反應底物，這也是GFP得到大量應用的原因。
▉ 各種顏色螢光蛋白的開發
從1994年到1999年，人們只克隆了一種螢光蛋白——維多利亞的綠色螢光蛋白(GFP)。但是科學家並不滿足於此，因此進行大量努力來創造不同顏色的綠色螢光蛋白變種，因為共軛結構是螢光蛋白發色的關鍵，對發色團進行點突變產生了以Phe、His或Trp取代Tyr66的藍色和青色突變體螢光蛋白；利用關鍵突變T203Y得到了激發發射最大值為515 529 nm的黃色突變體螢光蛋白。工程化改造的另一個目標是開發出更加明亮的螢光蛋白，螢光蛋白越亮，細胞內的濃度就越低，相比起背景，螢光亮度高，信噪比高，可以用於高靈敏度的對比成像。在綠色螢光蛋白改造過程中，美籍華人錢永健（Roger Tsien）做出了巨大的貢獻，開發出更亮的性質更穩定的GFP，通過解析發光原理開發出了具有豐富色彩的螢光蛋白。他因此與下村修（綠色螢光蛋白的發現者），Martin Chalfie（將綠色螢光蛋白應用於生物樣品標記）共享了2008年的諾貝爾化學獎。目前生物實驗室普遍使用的螢光蛋白大部分都是錢永健改造之後的變種。
螢光蛋白的開發年鑑
▉ 誘人的紅色螢光蛋白
在開發不同螢光的過程中，由於紅色螢光的諸多優點（下面會介紹），學術界和產業界在產生紅色螢光突變體蛋白領域做出了巨大的努力，很久的一段時間裡，沒有人在GFP的基礎上開發出進一步的紅移且最大發射波長超過529 nm的GFP突變體。1999年，俄羅斯科學家通過與水母（Aequorea）的綠色螢光蛋白（GFP）同源的Discosoma珊瑚中克隆出一種紅色螢光蛋白DsRED。該蛋白比GFP更大，但是，錢永健設法減小了DsRED的大小。他還從DsRED開發了一系列具有誘人名稱的紅色蛋白，例如mPlum，mCherry，mStrawberry，mOrange和mCitrine。
研究顯示，DsRED蛋白在成熟時，最大激發發射波長由未成熟的類似GFP的475nm/500nm紅移至558nm/583nm。推測其發光機理與GFP類似，在形成一個初步的對羥基苯咪唑啉酮的共軛結構後，α-C與66位的Gln的N之間脫氫，在咪唑環的2位形成了—C=N—C=O ，可以進一步擴展發色團，從而實現由綠到紅的轉變。mCherry蛋白以及錢永健推測的DsRED發光團形成機理紅色螢光的優點：
1. 較低的自發螢光和光毒性。光毒素是具有共軛系統（通常是芳香系統）的分子。它們具有較低的激發態，可以通過用可見光光子激發來實現。這種狀態會與組織中的相鄰分子發生系統間交叉，從而將它們轉化為有毒的自由基，它們迅速攻擊附近的分子，殺死細胞。紅色螢光的激發態更高，不容易被可見光光子激發。
2. 較強的組織穿透性。波長在650 - 900納米之間的長波光穿透動物組織最遠，因為組織吸收(即來自血紅蛋白、水和脂質)和光散射的綜合效應最小。
因此，紅外FPs (IFPs)作為蛋白質標籤和體內成像應用是首選。
由於紅色螢光的優越性質，研究者一直想改造出一個基於GFP的紅色螢光蛋白。不僅為了拓展分析的範圍，也為了改進其性質。
一種思路是維持發色團的穩定狀態。細胞的表觀亮度高度依賴於外在的環境條件。因此，許多策略的目標都是通過優化密碼子的使用，促進蛋白質摺疊，促進染色質成熟的程度和速度，以及通過降低pH和O2等環境幹擾的影響來提高蛋白質的穩定性。一些實驗當中為了維持發色團的穩定狀態需要特殊的環境條件，例如厭氧條件，紫外線照射，或者藍光照射或者給予額外的電子受體。由於對環境條件的要求高，這種策略很容易出現只有部分的綠-紅轉變的現象。
另一種思路是對發色團的胺基酸進行改造。例如插入含有不同結構的非天然胺基酸來調控發色團的結構。比如有人通過插入一個色氨酸類似物實現了由綠色向金色的轉變。另一些非天然胺基酸則可以實現螢光對不同條件的響應。但是種種努力都有一個共同的局限性：這些策略都有高度的特異性，只能針對性地一個一個進行設計，沒有一個通用的策略可以實現類GFP蛋白的由綠到紅的轉變。
最近，來自維吉尼亞大學的HuiWang Ai研究員在對GFP改造來開發新的生物傳感器的過程中，偶然發現了一種酪氨酸類似物aY ， 以密碼子拓展技術將其插入到GFP類蛋白的發色團中時，可以實現自發且高效的由綠到紅的轉變。他們嘗試在一些常用的螢光生物感受器中插入aY ，結果都發現其螢光發生了明顯的紅移，並且在很大程度上保留了其原本的亮度以及生物學性質。
經過aY改造後的sfGFP實現了明顯的紅移
aY與酪氨酸相比，僅在酚羥基的鄰位增加了一個氨基，為何能實現發色團的紅移呢？參照DsRED的發光機理，他們推測了aY參與的發色團形成過程：與GFP的發色過程類似，首先經過氧化環化形成了一個苯環與吡啶內酮的結構，之後，發生進一步的氧化，鄰位的氨基離去質子觸發了共軛結構內的電子轉移，形成了C=N—C=O 延長了共軛結構實現了發色團的紅移。
推測的aY參與形成發色團的過程
以往對於發色團的改造更多地集中在對於參與形成吡啶環的胺基酸改造上，偶然的發現這項工作選擇在苯環上進行改造，非常巧妙地實現了共軛結構的擴大，也給未來針對發色團改造的研究提供了新思路。所以大家在進行科學研究時，也不要放過實驗中的任何小細節，說不定偉大的發現就蘊含在這些不起眼的細節當中。
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