自 1992 年綠色螢光蛋白被用於標記基因，各種顏色的螢光蛋白被開發出，目前有上百種的螢光蛋白。
在我們的實驗中，經常會用到螢光蛋白，但是如何選擇合適螢光蛋白，得到完美的實驗結果？相信這個問題一直困擾著大家，鑑於此，小編從不同的角度去考慮如何選擇螢光蛋白，希望可以給大家在選擇螢光蛋白方面提供一些幫助。
Tubes of various fluorescent proteins displayed in a box with UV light shining on them.
單體性質
將螢光蛋白與目標蛋白進行融合表達，直接地追蹤目標蛋白或是定位目標蛋白，這就要求螢光蛋白是單體，不能影響目標蛋白的功能和定位。因此，我們將螢光蛋白的單體性質放在第一位。
目前體外檢測螢光蛋白單體性質的方法有分子篩、沉降平衡，可以通過螢光蛋白分子篩的峰圖是否狹窄，單一粗略的判斷其是否為單體，沉降平衡能夠更加準確的確認其聚合性質。我們使用螢光蛋白幾乎都是在細胞內或組織內，因此我們更加關心在生理條件下，螢光蛋白的聚合性質。
科學家巧妙地將螢光蛋白與細胞色素 P450 進行融合表達，讓螢光蛋白定位在內質網的胞質面，螢光蛋白的聚合性質會使鄰近的螢光蛋白聚合在一起，形成聚集體，在雷射共聚焦顯微鏡下能夠看到細胞核的周圍有很大的點狀結構。小編已經用此種方法檢測了多個螢光蛋白。
The structure of mEos2
小編發現綠色螢光蛋白中，單體性質比較好的是 mEmerald，該蛋白很少形成大的點狀結構，並且目前還沒有稱該蛋白會影響定位的報導。
此外 mEmerald 是一個非常穩定的綠色螢光蛋白，因此可以用於線性的結構光照明超分辨螢光顯微成像。
我們還發現紅色螢光蛋白中沒有一個單體性質特別好，相比較來說，mApple 的單體性質最好，但是在使用該蛋白的過程中，發現 mAppple 會影響某些蛋白的定位，因此在使用紅色螢光蛋白時，要謹記紅色螢光蛋白可能會影響目標蛋白的定位。
PK 值
每個螢光蛋白都有其最合適的 pH 值，即在一定的 pH 值下，螢光強度最高。有的螢光蛋白適合在酸性環境下使用，相反有的適合在鹼性環境下使用，因此在選擇螢光蛋白時需要考慮螢光蛋白的 PK 值。
Change in relative fluorescence intensity（RFU）with pH for eGFP（grey triangles）and bfloGFPa1（black squares）
在細胞內，大多數細胞器內及細胞質的 pH 值都在 7.0 左右，然而溶酶體內的 pH 值就比較低，因此常規的螢光蛋白並不適合用於標記溶酶體內的蛋白。
mCherry 的 PK 值比較低，適合在酸性的環境下使用，可以用於標記溶酶體內的蛋白，但是該螢光蛋白有一定的二聚性質，可能會影響目標蛋白的定位，在使用該螢光蛋白時要綜合考慮單體性質和 PK 值。
在選擇螢光蛋白時，要考慮目標蛋白定位環境的 pH 值，再考慮使用相應 PK 值的螢光蛋白。同時也可以考慮利用螢光蛋白的 PK 值的特性，幫助我們解決問題。
成熟時間
螢光蛋白在發光之前需要經歷轉錄、翻譯、摺疊等步驟，其中摺疊過程佔據了大部分時間，我們將此過程稱之為成熟時間。在標記短壽命的目標蛋白時，如果螢光蛋白的成熟時間太長，可能會出現在目標蛋白開始降解時，螢光蛋白還沒有發光，導致無法追蹤及定位目標蛋白。因此在選擇螢光蛋白時，需要考慮其成熟時間。
小編在實驗時發現，mEmerald、Dendra2 的成熟時間比較快，在用 Lipo2000 轉染試劑盒轉染 U2OS 細胞時，轉染後四個小時就能夠用螢光顯微鏡觀察到了螢光信號，EGFP 沒有信號。但是在用 P450 方法檢測時，Dendra2 會形成很大的聚集，表明該螢光蛋白的單體性質不好，有可能影響目標蛋白的定位和功能，在使用該蛋白的過程中應該注意這個特性。
為了能夠更早地觀察某些短壽命螢光蛋白的生理特性和定位情況，科學家正在發展成熟時間更快的螢光蛋白，並且用於超分辨成像。
光穩定性
螢光蛋白在發光的同時會被漂白，逐漸失去發光能力，因此要想獲得更多的信息，就需要螢光的光穩定性好。在普通的螢光成像中，對螢光蛋白的光穩定性要求並不是很高，比如雷射共聚焦顯微鏡成像時，螢光信號的穩定性只需要能保證採集的完整的一張圖即可。
在超分辨螢光成像中，對螢光蛋白的光穩定性要求比較高。線性結構光照明顯微鏡要求螢光蛋白始終處於亮的狀態，需要通過結構光採集多幅圖進行重構；非線性結構光顯微鏡則要求螢光蛋白在黑亮之間進行多次切換，這就要求螢光蛋白能進行反覆的光調控，並且依舊維持著高的亮度；與非線性結構光顯微鏡一樣，可逆飽和光線性螢光轉移顯微鏡也要求螢光蛋白能夠在黑亮之間進行反覆的光調控。
優化密碼子
大多數螢光蛋白是來自於海洋生物，因此密碼子偏好性與所要標記蛋白的物種有較大的差異，這種密碼子偏好性差異可能會導致螢光蛋白在哺乳動物細胞或組織中的表達量極低，以至於看不到螢光信號。
幸運的是大多數螢光蛋白的密碼子已經經過優化，適合在哺乳動物細胞中進行融合表達。但是當需要使用螢光蛋白在其他種屬細胞內表達時，應考慮一下密碼子偏好性。
小編在進行線蟲螢光成像時，就遇到過此類問題，沒有優化密碼子時，螢光蛋白的表達量比較弱，在螢光蛋白經過密碼密碼子優化，並且在 DNA 序列之間插入線蟲的內含子後，螢光蛋白的表達量得到了較大的提高。
在比較少見的物種進行螢光成像時，需要把密碼子優化這個特性考慮在內。
N 端或 C 端
在選擇了相應的螢光蛋白後，我們需要確定把目標蛋白放在螢光蛋白的 N 端或是 C 端。N 端與 C 端的區別在於目的蛋白，有的目的蛋白對這個要求不高，但某些目的蛋白就要求在特定的位置進行融合表達。
螢光蛋白與目的蛋白融合表達可能會影響目的蛋白的摺疊，這取決於目的蛋白摺疊過程中，螢光蛋白所在的那一端有沒有參與蛋白質的摺疊。
例如，如果目的蛋白的 C 端會被摺疊入目的蛋白的內側，那麼我們把螢光蛋白標記在目的蛋白的 C 端，將獲得不到螢光信號；有些目的蛋白在後翻譯的過程會切掉一段，如果螢光蛋白處於被切的一端，那麼就不能獲得準確的目的蛋白的定位信息。
如果標記的目的蛋白是一個新的蛋白，我們建議分別進行 N 端和 C 端融合表達，以此來確定哪一個是最好的選擇。除此之外，還可以用免疫螢光來確認目的蛋白定位是否與螢光蛋白融合表達的一致。
綜合以上的介紹，在我們選擇螢光蛋白時，首要考慮的是螢光蛋白的聚合性質，即是否會影響目的蛋白的功能及定位，其次是螢光蛋白的 PK 值是否與目的蛋白所處的環境的 pH 值相匹配，然後是螢光蛋白的成熟時間以及目的蛋白的壽命，綜合兩者決定螢光蛋白是否合適，最後考慮螢光蛋白的光穩定性、密碼子偏好性是否合適，最後考慮目的蛋白放的位置，螢光蛋白是否會影響目的蛋白的功能及定位。
此外，在進行螢光成像時，需要考慮顯微鏡所選的濾光片是否與相應的螢光蛋白質配套，顯微鏡的各種參數是否合適。值得提醒的是，激發光的強度不能太高，否則會導致螢光信號的漂白。
最後，給大家安利一個網站，希望能讓大家的實驗得到幫助，裡面有很多螢光蛋白的性質信息。（點擊連結）
參考文獻
1. Zhang MS, Fu ZF, & Xu PY (2016) Extending the spatiotemporal resolution of super-resolution microscopies using photomodulatable fluorescent proteins. J Innov Opt Heal Sci 9(3).
2. Zhang MS, et al. (2012) Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nat Methods 9(7):727-U297.
3. Costantini LM, Fossati M, Francolini M, & Snapp EL (2012) Assessing the Tendency of Fluorescent Proteins to Oligomerize Under Physiologic Conditions. Traffic 13(5):643-649.
4. Zhang X, et al. (2016) Highly photostable, reversibly photoswitchable fluorescent protein with high contrast ratio for live-cell superresolution microscopy. P Natl Acad Sci USA 113(37):10364-10369.
5. Li D, et al. (2015) Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science 349(6251).
6. Wang S, et al. (2016) GMars-Q Enables Long-Term Live-Cell Parallelized Reversible Saturable Optical Fluorescence Transitions Nanoscopy. Acs Nano 10(10):9136-9144.
7. Kilaru S, et al. (2015) A codon-optimized green fluorescent protein for live cell imaging in Zymoseptoria tritici. Fungal Genet Biol 79:125-131.