從 1962 年下村修等在名為 Aequorea victoria 的水母體內發現並分離得到最早的螢光蛋白綠色螢光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)開始，人們對於螢光蛋白的進一步研究和應用都沒有停止過。研究者通過一系列突變得到各種不同波長的突變體,大大豐富了螢光蛋白的家族成員。如此大量的螢光蛋白使得其在蛋白質分子標記和細胞內示蹤等方面得到了大量的應用。
在紅色螢光蛋白發現以前,GFP 雖然能幫助生物科學家解決一些問題,但由於其發射光譜僅僅局限在 440-529 nm,細胞內成像時背景較高,不能夠解決活體生物皮下更深的螢光標記問題。1999 年紅色螢光蛋白首次被報導,紅色螢光蛋白能夠與 GFP 共用,激發和發射波長更長,最重要的是其在細胞內成像時背景低。這些優點促使科學家們對紅色螢光蛋白進行了系列研究,極大的完善了其多樣性。
研究者在應用紅色螢光蛋白的時候也發現了一些問題,如野生型的紅色螢光蛋白成熟速度慢且多以四聚體或二聚體形式出現,對細胞有一定的毒性作用。
最早用於研究的紅色螢光蛋白是 DsRed,它是一種從珊瑚中分離出來的紅色螢光蛋白,具有螢光強、穩定性好等優勢。但其本身也存在許多問題。例如,DsRed 寡聚狀態是四聚體,在進行蛋白融合時容易形成多聚影響目標蛋白 ;DsRed 在細胞內表達會產生毒性。
常規紅色螢光蛋白
常規紅色螢光蛋白也叫做永久螢光蛋白,可以分為橙色螢光蛋白(550-570 nm),紅色螢光蛋白(570-620 nm)和遠紅外螢光蛋白(>620 nm)3 種。
現代紅色螢光蛋白與第一代常規紅色螢光蛋白相比有增強的螢光特性。例如 mOrange2 和TagRFP-T 與 他 們 的 祖 先 mOrange 和 TagRFP相比其光穩定性更強。其他橙色螢光蛋白,如mKO2和 mKOk與其祖先相比更明亮,具有更快的成熟時間,然而,他們的光穩定性較低。最近 Bindels 等研究產生的 mScarlet 為單體紅色螢光蛋白,與其他紅色螢光蛋白相比更適合作為融合標籤。2016 年 Pandelieva 等在 mRojoA 的發色團之上引入芳香殘基降低發色團的構想靈活性,這種突變使得其比前提的螢光蛋白量子產率提高了 3 倍以上。而且通過對突變體的晶體結構表明,發色團夾在芳環三層基序中的兩個 Tyr 殘基之間,這種基序的存在增加了發色團的剛性。Pandelieva提出的方法為具有較高量子產率和總體亮度的螢光蛋白的發展提供了一個選擇。儘管現代紅色螢光蛋白在某些特定應用方面有一定的優勢,但一些早期的紅色螢光蛋白是仍然存在競爭力的。2016 年 Fan報導的 rxRFP1 對於氧化還原反應敏感,能夠用於研究各亞細胞域的氧化還原動力學。通常 mCherry是作為標籤的好選擇,因為它的光穩定性更強並且其具備良好的單體特性,細胞毒性低。2015 年Wannier 等通過計算設計的手段結合表面突變,創建了一種 DsRed 和 mCherry 的混合 RFP 不僅保持了單體性而且螢光不受損,相信這種方法對於以後的螢光蛋白改造有很大的意義。
目前為止報導的天然紅色螢光蛋白最長發射光波長為 613 nm,是來自Nematostella vectensis 體內的 NvFP-7R 。Ren H 等經過在 mKate2的發色團附近引入半胱氨酸得到新的遠紅外紅色螢光蛋白 mStable,該突變體比其前提穩定性增強 12 倍,而且他們還對 mPlum 進行了同樣的改變得到了穩定性增強 23 倍的突變體,這種突變代表了一種生產更好穩定性螢光蛋白的一種機制。