2017-07-21 生物物理研究所
語音播報
6月19日，英國皇家化學會主辦刊物Chemical Communications（ChemComm）以封面論文（Inside Front Cover）的形式在線發表了中國科學院生物物理研究所柯莎（Sarah Perrett）研究組題為A Co-expression Strategy to Achieve Labeling of Individual Subunits within a Dimeric Protein for Single Molecule Analysis的文章，論文報導了一種基於共表達的方式獲得異二聚體蛋白，以實現對二體蛋白中某一單體上進行位點特異性螢光標記的方法，該方法可應用於二聚體蛋白構象及動力學機制的單分子FRET研究。
單分子螢光共振能量轉移（smFRET）是研究生物大分子的構象及動力學機制的重要方法，尤其對於結構生物學手段不易解析的無序蛋白（intrinsically disordered protein），單分子FRET技術可通過測量標記的螢光供體與受體染料對之間的距離，分析無序蛋白的結構和構象信息。單分子FRET研究首先需要在目標蛋白特定位點標記螢光分子，目前廣泛使用的標記方法是引入半胱氨酸殘基定點突變再與馬來醯亞胺官能化染料進行共價反應。上述方法僅適用於單體蛋白，而生物體中許多蛋白質均以二聚或寡聚狀態存在及行使功能，對於這些蛋白難以通過傳統的半胱氨酸標記方法對其進行單一FRET染料對的位點特異性標記。在以往的研究中，對於二聚體蛋白多採用亞基交換獲得異二聚體，或截斷二聚體作用界面的結構域使之形成單體再進行單分子FRET實驗，但這些方法有明顯的局限性。
本研究提出了一個共表達的策略，即利用pQLink載體同時表達野生型及突變型的蛋白，獲得由一個無標記單體與一個特異性標記FRET染料對的單體組成的異二聚體。文章以釀酒酵母prion蛋白Ure2（其天然態以穩定二聚體形式存在）為例，基於上述標記策略將FRET染料對分別標記於Ure2 N端prion無序結構域以及C端球形功能結構域，採用單分子FRET技術確定了N端結構域相對於C端結構域的空間位置及其發生相互作用的區域。這種新的標記方法克服了經典的半胱氨酸標記二聚體蛋白質的局限性，且具有普適性，使單分子FRET技術可擴展研究具有重要生物學功能的二聚體蛋白。
生物物理所研究員柯莎和副研究員吳思為本文的共同通訊作者，柯莎課題組的博士生婁飛為本文的第一作者，博士生楊潔為參與者。該研究得到了科技部973計劃、自然科學基金委項目等的資助。
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共表達異二聚體的構建及在單分子FRET研究Ure2 prion結構域中的應用
6月19日，英國皇家化學會主辦刊物Chemical Communications（ChemComm）以封面論文（Inside Front Cover）的形式在線發表了中國科學院生物物理研究所柯莎（Sarah Perrett）研究組題為A Co-expression Strategy to Achieve Labeling of Individual Subunits within a Dimeric Protein for Single Molecule Analysis的文章，論文報導了一種基於共表達的方式獲得異二聚體蛋白，以實現對二體蛋白中某一單體上進行位點特異性螢光標記的方法，該方法可應用於二聚體蛋白構象及動力學機制的單分子FRET研究。
單分子螢光共振能量轉移（smFRET）是研究生物大分子的構象及動力學機制的重要方法，尤其對於結構生物學手段不易解析的無序蛋白（intrinsically disordered protein），單分子FRET技術可通過測量標記的螢光供體與受體染料對之間的距離，分析無序蛋白的結構和構象信息。單分子FRET研究首先需要在目標蛋白特定位點標記螢光分子，目前廣泛使用的標記方法是引入半胱氨酸殘基定點突變再與馬來醯亞胺官能化染料進行共價反應。上述方法僅適用於單體蛋白，而生物體中許多蛋白質均以二聚或寡聚狀態存在及行使功能，對於這些蛋白難以通過傳統的半胱氨酸標記方法對其進行單一FRET染料對的位點特異性標記。在以往的研究中，對於二聚體蛋白多採用亞基交換獲得異二聚體，或截斷二聚體作用界面的結構域使之形成單體再進行單分子FRET實驗，但這些方法有明顯的局限性。
本研究提出了一個共表達的策略，即利用pQLink載體同時表達野生型及突變型的蛋白，獲得由一個無標記單體與一個特異性標記FRET染料對的單體組成的異二聚體。文章以釀酒酵母prion蛋白Ure2（其天然態以穩定二聚體形式存在）為例，基於上述標記策略將FRET染料對分別標記於Ure2 N端prion無序結構域以及C端球形功能結構域，採用單分子FRET技術確定了N端結構域相對於C端結構域的空間位置及其發生相互作用的區域。這種新的標記方法克服了經典的半胱氨酸標記二聚體蛋白質的局限性，且具有普適性，使單分子FRET技術可擴展研究具有重要生物學功能的二聚體蛋白。
生物物理所研究員柯莎和副研究員吳思為本文的共同通訊作者，柯莎課題組的博士生婁飛為本文的第一作者，博士生楊潔為參與者。該研究得到了科技部973計劃、自然科學基金委項目等的資助。
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共表達異二聚體的構建及在單分子FRET研究Ure2 prion結構域中的應用