從2010年回國至今整整10年，北京生命科學研究所研究員何萬中終於在黑暗中探出了一道光，給自己和支持者們上交了一份滿意「答卷」。
這道光就是，他帶領團隊原創性地開發了一種新型克隆電鏡標記技術，該技術可直接在細胞中遺傳編碼表達的標記蛋白上原位合成納米金顆粒，從而實現細胞超微結構上單分子水平的精確識別與定位，為細胞的電鏡超微結構單分子水平研究提供了新工具。
北京時間2020年8月10日晚23時，相關研究成果在線發表於《自然—方法》。
何萬中稱這10年是一場「大冒險」，「原創探索不僅沒有效率，還要頂著壓力和風險，有的只是堅持只做真正原創工作的信念。」
3年沒有成果，「逼」走了一位工程師
電鏡超微結構水平細胞中的單分子可視化技術是細胞生物學家期盼已久的工具。
當今，生命科學已進入分子生物學時代，人們對生命現象的研究已經深入到單細胞、單分子的納米尺度水平，如何在這樣的尺度範圍內定位、識別、操縱目標分子，從而獲取功能性的生物化學信息，將對生命現象的解讀等意義重大。
論文通訊作者何萬中告訴《中國科學報》，近50年來，識別細胞中的蛋白質分子主要依賴傳統的抗體免疫金標記技術，但受到抗體及抗原的穩定性和特異性、化學固定劑、細胞切片滲透性、膠體金顆粒大小等因素影響，該技術通常標記效率很低(低於10%)，甚至無法標記，多數情況也只能標記上細胞切片表面的極少部分抗原，且還要受到背景噪聲幹擾。
此外，傳統免疫標記需要標記每一個切片，對於細胞組織樣品大尺度的標記是十分費錢、費時、費力的工作。
超解析度螢光顯微學成像技術發展，使得單分子水平的細胞成像成為現實，不過，其也只能對有標記的少數分子成像，對沒有標記的多數分子甚至細胞器成像時仍是一片「模糊」。
因此，細胞生物學家迫切希望電鏡領域也能夠開發出類似光學顯微成像領域廣泛應用的綠色螢光蛋白（GFP）標記技術，通過遺傳操作來實現細胞及生物組織在電鏡超微結構樣品上的分子識別和精確定位。科學家將這種技術稱為「基於遺傳編碼的可克隆電鏡標記技術」。
為此，科學家們嘗試探索開發可克隆電鏡標記，比如：利用重金屬離子直接與標記蛋白（包括富含半胱氨酸的金屬結合蛋白、鐵蛋白多聚合體等）結合形成納米金屬顆粒示蹤的方式。在電鏡下，納米金屬顆粒表現為一個「大黑點」，類似螢光顯微成像的綠色螢光蛋白，可讓目標分子從細胞中無數分子中「脫穎而出」。
2007年，何萬中在美國加州理工學院做博士後時，發明了冷凍細胞內吞納米金顆粒原位增大技術，可在超微結構水平示蹤每個被細胞內吞的抗體共價交聯的1.4納米金簇，相關成果在《自然》雜誌刊發。不過，該技術基於細胞內吞機制，並不適合標記細胞內部絕大多數分子。
此時，他敏銳地注意到2006年David DeRosier博士剛剛提出的基於富含半胱氨酸的金屬蛋白（MT）的開發可克隆電鏡標記新概念極具潛力解決上述問題，隨後，何萬中獨立組建實驗室，立刻著手將MT改造成更好的MTn和MTa，從此走上了長達十年的可克隆電鏡標記技術漫長而艱辛的開發之路。
事實上，國際上有5個團隊先後對該技術有過探索，但因諸多技術障礙沒有攻克，如存在無可避免的「背景噪聲」導致特異性差，金離子無法有效進入細胞，不耐化學固定劑，合成納米金顆粒效率低且顆粒極小等，因此，迄今無人開發成功細胞超微結構單分子水平的可克隆電鏡標記技術。
2010年，入職北京生命科學研究所後，何萬中建立團隊開始致力於攻克上述難題。
經歷3年艱難探索，始終存在的非特異性背景噪聲成為他們遲遲難以突破的技術障礙，其中一位負責該金顆粒合成的工程師認為成功希望渺茫，無奈之下，他放棄項目離開了團隊。
何萬中不甘心就此止步，「概念有了，就是一步步解決這個關鍵問題的事兒，我相信肯定能夠解決的。」
圖：何萬中和三位第一作者（從右至左：何萬中，姜招弟，金秀梅，李玉華）
「意外的收穫」
做生物物理學交叉研究多年的何萬中，決定自學化學知識攻克這個難題，他把自己關在辦公室研讀化學文獻。
在一個周末，他閱讀的一篇文獻提到，一價金離子可以與氮、氧、硫等諸多元素有著不同的結合強度（與硫結合比氮氧更強），他馬上聯想到一價金離子與不同含巰基（含硫）化合物之間也有不同結合強度。
這使他眼前一亮：蛋白質的20種胺基酸由碳、氫、氧、氮、硫等有限幾種元素組成的，如果設計一種方法，找到一種與金離子結合的含硫（巰基）化合物做反應前體，讓金離子只與標記上的半胱氨酸的硫結合，而不與其他元素組合，不就可以形成特異性納米金顆粒同時避免背景噪聲了麼？
因為手邊沒有現成化合物，他就地取材，在實驗室找到巰基乙醇，並「隨意」加入含0.1%的氯金酸試管中，現場合成金的硫醇鹽做前體，結果發現本應渾濁的液體居然是透明的。
因無法短期內提純這種金的硫醇鹽，於是他把這種「透明」溶液，直接加入了含有對照蛋白和另外兩種標記蛋白的三個離心管中，溶液依然透明（意味著沒有形成金顆粒）。
此時，他想到了Brust-Schiffrin方法(BSM)合成硫醇(RSH)包被的納米金顆粒基本原理，便立馬又加入了強還原劑硼氫化鈉溶液，令人意外的現象發生了：含對照蛋白的那個離心管裡依然無色透明，而含標記蛋白的兩個離心管變成了深棕色！ 「這很有可能意味著背景噪聲的消失。」何萬中說。
於是，第二天他找團隊新成員、有著化學背景的金秀梅開展重複實驗，結果怎麼都重複不出來，原因在於前一天的「隨意」實驗沒有嚴格濃度控制。
經過很多次不同濃度的配比探索，終於發現，當在硫醇陰離子與三價金離子濃度比率≥2:1的條件下，上述現象再次重現了。
隨後，經過理論和實驗分析，何萬中發現：經典的BSM合成納米金顆粒通常是在硫醇陰離子與三價金離子濃度比率 < 2:1條件進行，會形成巰基與金離子形成1:1 RSAu(I)鏈狀聚合物經Au（I）離子間的範德華力聚集為成核中心，再經強還原劑硼氫化鈉還原成納米金顆粒。
而現在發現的硫醇陰離子與三價金離子的濃度比率≥2:1條件，可形成另一種2:1 的可溶RSAu(I)金硫醇鹽，不能自發形成成核中心（這就是控制樣品中沒有形成金顆粒的原因），何萬中把這種機制命名為 「自成核抑制機制（ANSM）」。
何萬中解釋，當把富含半胱氨酸的標記蛋白加入ANSM的反應體系時，標記蛋白上的巰基與金離子會形成RSAu(I)類似的鏈狀聚合物成為成核中心，此時溶液裡完全沒有非標記的自成核鏈狀聚合物（背景噪聲），因此加入強還原劑硼氫化鈉溶液後在標記蛋白上特異性合成納米金顆粒就毫不奇怪了！
這是一個由於實驗時試劑濃度不嚴格而帶來的「意外」科學發現。「ANSM金顆粒合成化學原理的關鍵發現，為後續可克隆標記技術在細胞中的實現與優化奠定了堅實的理論基礎。」何萬中興奮地說。
隨後，何萬中帶著團隊又花費7年時間，攻克了可克隆電鏡標記技術在細胞的開發實現中的一系列技術挑戰。
他們首先成功開發了一系列針對純化的標記蛋白特異性合成 2-6 納米大小的金顆粒技術，並證明納米金顆粒時在單個標記分子上形成的。
利用簡單的原核細胞 (大腸桿菌系統)摸索優化出細胞中的標記蛋白上特異性合成納米金顆粒的實驗方案，獲得了前所未有超高標記效率。
此時，受過細胞電鏡制樣技術系統訓練的博士生薑招弟加入團隊，主攻在真核細胞應用中的難題。經過技術探索和迭代演進，他們將細菌和酵母中摸索出來的金顆粒合成技術推廣至哺乳動物細胞。
研究人員用冷凍替代固定條件下只用鞣酸(tannic acid)與醋酸鈾聯合的低溫脫水固定，避免使用巰基氧化劑和醛固定劑，實現保證細胞超微結構下高效合成納米金顆粒，且不再受標記蛋白摺疊狀態限制。
經試驗測試證明，該方案已經高度成熟有效，重複率極高，可以廣泛推廣使用。「這也意味著終於全面攻克了在保證細胞超微結構前提下如何在標記蛋白上高效合成納米金顆粒的難題。」何萬中說。
圖：新型可克隆電鏡標記技術的實現
「做真正原創技術」
令研究人員感到欣喜的還有，他們開發的基於自成核抑制機制在富含半胱氨酸標記蛋白上合成納米金顆粒技術，合成條件比較溫和，接近生理條件，可用來開發一系列新型單分子探針。
例如，他們利用大腸桿菌表達純化的綠色螢光蛋白納米抗體(GBP) 與 MT標記的融合蛋白GBP-MT， 可成功免疫標記細胞中表達的綠色螢光標記蛋白，這顯示出該技術可廣泛用來標記目前已有綠色螢光蛋白標記的各種細胞及動物組織。
此外，在其他通用抗體、冷凍電鏡分子標記等也具備應用潛力。
論文3位審稿人均對該研究給予高度評價。「該技術是對前人提出的基因編碼電鏡標記概念的深入探索與實現……總體看，我認為這項工作會非常有用」「該研究有望成為電子顯微學領域裡程碑式的論文」「我認為這項工作是細胞生物學研究方法的重大進展」。
何萬中感到收穫的喜悅的同時，他坦承，這場「大冒險」很「折騰」，需要超長的耐力，需要不斷探索積累直至靈感閃現的時刻。
儘管中途有很多次發文章的機會，但他們都決心沉下心，一定要把問題研究透徹，直到真正創造出可在未來幾十年甚至更長時間裡被廣泛應用的新技術。
「從發論文效率上來看，我是個失敗者；但從真正創新意義上來說，我是成功的。」何萬中同時指出，「此項馬拉松式的原創研究工作的成功，離不開北京生命科學研究所這種特殊資助體制，以及王曉東所長對原創工作的充分理解和堅定支持。」
接下來，他希望進一步優化技術，從單分子標記拓展到兩個、三個甚至更多目標分子的同時標記；通過一些設計，提高分子的表達量，開發適應各種條件的、對目標分子影響更小的標記技術等，讓該技術獲得國際同行的廣泛應用。
相關論文信息：
DOI: https://doi.org/10.1038/s41592-020-0911-z