註：文末有研究團隊簡介 及科研思路分析
近年來，單分子螢光技術得到了快速發展，廣泛應用於生命科學、化學和材料科學領域。然而傳統的基於全內反射螢光顯微鏡（TIRF）的單分子螢光技術只能在溶液中濃度不超過50 nM螢光標記物種的條件下進行測量。該濃度限制遠低於許多生物大分子的生理濃度和許多生化過程的結合常數，制約了單分子螢光技術的應用。近日，清華大學生命科學學院的陳春來研究組利用光激活的螢光團代替傳統螢光團，發展了突破全內反射螢光顯微技術中螢光濃度屏障的通用方法，將標記物種的最高濃度限值提高了2-3個數量級，從而可以在接近生理條件的μM濃度下進行單分子FRET測量。
單分子螢光技術可以在複雜體系內實時觀測生物分子的動態過程，並揭示隱藏在傳統系綜平均測量中的重要信息，包括生物分子之間的差異性以及反應過程中的瞬時中間態等。基於全內反射螢光顯微鏡的單分子螢光共振能量轉移技術（FRET）已廣泛應用於研究生物大分子的自身構型變化和分子間的相互作用等動態過程。然而，基於全內反射螢光顯微鏡的單分子FRET技術仍然存在著缺陷和不足。全內反射螢光顯微鏡中最高可使用的螢光標記樣品濃度，即螢光濃度屏障在50 nM左右，遠低於許多生化反應的結合常數，也遠低於許多生物分子在生理條件下的濃度（μM量級）。
清華大學的研究團隊基於光激活染料開發了光激活單分子FRET（sm-PAFRET）的新方法，有效突破了單分子FRET技術中的螢光濃度屏障（圖1）。他們利用激活光源（紫色）將玻片表面附近的光激活螢光團（黑色）都轉變為可發射螢光的激活態（綠色）。待激活光源關閉後，在溶液中自由擴散的激活態螢光團會快速擴散離開玻片表面，而只有固定或與表面生物大分子反應的激活態螢光團標記分子才會被隨後照明的激發光源（綠色）激發產生螢光。通過激活和激發光源的交替照明，他們可以不斷地激活實驗觀測過程中結合到表面的螢光團，並測量其單分子FRET，實現在高濃度螢光標記物種的條件下進行基於全內反射螢光顯微鏡的單分子FRET實驗。該方法簡單易行，商業化可光激活的螢光團可通過購買獲得，而顯微鏡的硬體和控制方面也只需在全內反射螢光顯微鏡（TIRF）上裝配激活光源和激發光源，並可對其進行控制和快速切換。
圖1. 光激活單分子FRET（sm-PAFRET）的原理示意圖
這一新方法可廣泛應用於生物大分子的動態研究，例如原核核糖體的翻譯延伸過程中，延伸因子G (EF-G)可以催化轉運RNA (tRNA)和信使RNA (mRNA)在核糖體上移動。利用sm-PAFRET，他們首次發現當延伸因子G (EF-G)的濃度從14 nM增加至接近生理濃度1.4 μM時，核糖體會採取不同的翻譯延伸途徑。因此，在低濃度下捕捉到生物大分子的動態變化有可能無法代表生理條件下生物大分子實際的狀態。因此，在接近生理濃度的條件下的單分子實驗有望揭示更多未知的分子機制。
這一成果近期發表在Angewandte Chemie International Edition 上，文章的第一作者是清華大學生命科學學院的博士研究生彭思佳。
該論文作者為：Sijia Peng, Ruirui Sun, Wenjuan Wang, Chunlai Chen
原文（掃描或長按二維碼，識別後直達原文頁面）：
Single-Molecule Photoactivation FRET: A General and Easy-To-Implement Approach To Break the Concentration Barrier
Angew. Chem. Int. Ed., 2017, DOI: 10.1002/anie.201702731
研究團隊簡介
陳春來，博士，研究員，博士生導師；2003年本科畢業於北京大學化學與分子工程學院，2008年獲得北京大學化學生物學博士學位；2008年7月至2015年2月在美國賓夕法尼亞大學醫學院生理系從事博士後研究，2015年3月起任清華大學生命科學學院研究員。
教育和工作經歷
1999-2003，學士，北京大學化學與分子工程學院
2003-2008，博士，北京大學化學與分子工程學院
2008-2015，博士後/研究員，University of Pennsylvania
2015至今，研究員，清華大學生命科學學院、清華大學-北京大學生命科學聯合中心（CLS）
主要研究方向
1）發展單分子螢光方法和技術；
2）核糖體在蛋白質合成過程中翻譯和調控機制的研究；
3）CRISPR系列蛋白靶向和剪切機制的研究。
http://www.x-mol.com/university/faculty/45877
科研思路分析
Q：該研究的想法是怎麼產生的？
A：我們一直致力於發展單分子螢光的新方法和技術，並利用單分子螢光技術研究和揭示生物大分子的動態過程和分子機制。如上所述，目前單分子FRET技術的濃度屏障是50 nM，遠低於許多生化反應的結合常數，也遠低於許多生物分子在生理條件下的濃度（μM量級）。而現有的突破單分子成像濃度屏障的方法操作複雜、難度大，系統難以建立、使用和維護，因此我們希望可以找到一種簡單易行的方法。基於光激活的螢光染料，激活和激發光源交替照明可以不斷地激活實驗觀測過程中結合到表面的螢光團，進而發展出這一較為簡便的突破濃度限制的單分子FRET成像新方法
Q：研究過程中遇到哪些難點？
A：該研究中的難點是光激活螢光染料對生物大分子的標記。商業化的光激活螢光染料可選種類較少，染料的發光性能不如傳統的螢光染料，水溶性差。因而不同樣品需要尋找合適的標記條件以及標記後樣品的純化條件，以最大的可能性提高標記效率和產率。在這一過程中，我們團隊在螢光染料標記方面的經驗積累起到了重要的作用。
Q：突破單分子螢光成像濃度屏障有哪些未來發展方向？
A：1）現有技術的優化使這些技術更加簡便易行，可廣泛被許多實驗室使用。2）新技術的開發：針對研究對象開發特定的技術，如利用線性的零模波導技術對分子馬達蛋白的遷移進行觀測等。3）樣品製備：包括設計和製備具有獨特性質的螢光團進行高濃度下的單分子螢光成像以及發展更加簡單有效的方法來大規模製備標記的生物樣品。
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