四點建議,讓你的免疫螢光染色少走彎路

近年來隨著儀器和試劑的不斷發展，幾乎所有的免疫檢測應用都可以獲得螢光讀數。不過，儘管免疫螢光技術能夠提供靈敏而準確的結果，並適合多重檢測，但優化還是必不可少的。

在此，MilliporeSigma 的培訓經理Chandra Mohan博士和抗體驗證科學家Robin Clark博士分享了他們在免疫螢光染色方面的成功經驗。

操作方案要優化

免疫螢光染色的操作方案通常包括：固定和透化、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、再次洗滌以及測定讀數。Clark解釋說：「大多數研究人員的染色方案都是一成不變的，因此我們建議在使用珍貴的樣本材料時，花點時間優化操作方案的每一步。」

Mohan指出：「就一抗孵育而言，你必須考慮抗體的建議稀釋度，以實現高的信背比。若抗體濃度過低，則螢光信號較弱，可能難以與背景區分開，但抗體濃度過高，則會導致較高的背景染色。」

Clark還提醒，千萬不要低估各步驟之間徹底洗滌的重要性。「利用生理溶液來洗滌，可去除未結合的螢光試劑，或那些只是粘在目標上而非特異性結合的螢光試劑，從而提高信背比。」

螢光試劑要放好

儘管許多螢光基團具有相對的光穩定性，但在保存和染色過程中若未能避光，則可能導致螢光基團-抗體結合物降解，引起假陰性結果。Clark強調，螢光物質必須在建議溫度下小心保存，並始終注意避光，以保護其光譜完整性。他特別指出，串聯的螢光基團對頻繁操作引起的不穩定性特別敏感。

Mohan也補充說：「儘管免疫螢光技術提供了準確的結果，但也存在一些缺點，包括自發螢光、螢光信號的淬滅，以及標本存儲過程中的信號褪色。按照建議的實驗方案來操作，研究人員可以避免一些技術上的缺陷。」

選擇螢光要謹慎

免疫螢光技術的一個主要優勢在於它為多重檢測提供了機會，如今流式細胞儀能檢測每個細胞中20多個離散參數。在設計多重實驗時，應考慮每種螢光基團的獨特性質，如最大吸收波長和最大發射波長，消光係數和斯託克斯位移等因素。

Mohan表示：「人們通常要檢測組織或細胞樣本中的多個抗原，必須選擇光譜不重疊的螢光基團。即使是最好的檢測系統，也無法克服儀器和試劑之間的不匹配。」

合適對照不可少

任何實驗數據的分析都依賴於相關的對照，免疫螢光染色也不例外。「不加一抗，則能說明觀察到的信號是否來源於二抗與組織或細胞樣本的非特異性結合，」Clark解釋說。「此外，我們建議使用不表達目標的細胞或組織作為陰性對照。同時，為了確保所有組分都正常發揮作用，那些已知表達目標的陽性對照也少不了。在螢光Western blot或ELISA技術中，含有目標抗原的蛋白或肽段適合作為陽性對照。」

總之，免疫螢光染色是一種流行且強大的檢測方法。通過精心選擇螢光基團，並開發可靠的染色方案，你可以生成豐富的數據。