【染色質免疫共沉澱】ChIP 抗體如何選擇?

2021-01-18 達科為生物城

隨著時間的推移,表觀遺傳學的研究工具已經從PCR到qPCR,並演變出在全基因組範圍內進行研究和分析的染色質免疫沉澱技術,也就是目前火熱的ChIP技術。


染色質免疫共沉澱技術(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也稱結合位點分析法,是研究體內蛋白質與DNA相互作用的有力工具,通常用於轉錄因子結合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。


將CHIP與第二代測序技術相結合的ChIP-Seq技術,能夠高效地在全基因組範圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段。首先通過染色質免疫共沉澱技術(ChIP)特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,並對其進行純化與文庫構建;然後對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過將獲得的數百萬條序列標籤精確定位到基因組上,從而獲得全基因組範圍內與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段信息。


由於ChIP實驗的準確性和覆蓋範圍優於PCR、qPCR,ChIP-seq現已成為染色質研究的金標準;但是,成功的ChIP-seq,在ChIP實驗的所有步驟中都需要較高水平的實驗準確性和一致性。


ChIP抗體的選擇在實驗中是最重要的一個環節,它影響著ChIP實驗的成敗與否。那麼ChIP-seq抗體需要如何選擇呢?


無論是單克隆還是多克隆抗體都可用於ChIP實驗。單克隆抗體識別靶蛋白上的單一表位,它們具有很高的特異性結合,低非特異性結合和低背景信號等特點。其次,由於克隆性質的低變異性,單克隆抗體具有更高的批次間穩定性。


但是,如果存在其它與染色質結合的蛋白,可能導致單克隆識別的表位不可接近;或由於需要識別的表位在交聯過程中被掩蔽,單克隆抗體不能有效地與蛋白結合。幸運的是掩蔽的情況並不常見,因此,單克隆抗體不僅適用於ChIP實驗,而且通常具有較好的實驗結果。

 

與單克隆抗體相比,多克隆抗體能識別靶蛋白上的多個表位,即使存在少數表位掩蔽的情況,也不會影響抗體有效地檢測到靶標,實驗成功率更高。也正是由於多克隆抗體可以識別多個表位,從而會增加抗體發生非特異性結合的概率。


ChIP級別的抗體對抗體純度、特異性結合的要求都比較高,是完成ChIP實驗的首選抗體。如果沒有找到目的基因的ChIP-seq級別的抗體,通過ChIP和IP驗證的抗體也可以使用,但是儘量不要使用沒有標註ChIP應用的抗體,或者標註未檢測的抗體,否則通常是浪費時間。


為了節省篩選候選抗體的時間,我們可以考慮抗體來自其他免疫實驗檢測的數據,它們作為抗體在ChIP中工作良好的可能性的指標。蛋白印跡和免疫沉澱測定可以驗證抗體是否能識別正確的靶標;免疫螢光分析可以確定抗體是否識別其天然狀態的靶標,這些數據對於檢測抗體是否適合ChIP實驗非常重要。


經過免疫沉澱、免疫螢光或免疫組織化學中驗證的抗體,比僅通過Western blot驗證的抗體更有可能產生陽性的ChIP實驗結果。當然,這些應用中的性能並不能保證ChIP的成功,因為成功的ChIP抗體必須識別可接近的抗原表位,這些表位不應該受ChIP交聯方法的影響。


因此,想知道一支抗體的ChIP數據是否可用,可考慮如下相關問題:


選擇ChIP抗體和進行ChIP實驗之前,對抗體的特異性評估很重要。尤其是組蛋白相關抗體的選擇更是如此。


同時,很多期刊雜誌也逐漸將組蛋白抗體特異性表現作為文章發表的條件,因此,進行抗體篩選測定以檢測抗體質量和結合能力是非常重要的。


ChIP抗體選擇的關鍵是:


Premium抗體通過了最嚴格的QC測試 (包括生物信息學,並與Broad Institute的Encode參考數據集進行了比較)。Diagenode的合作夥伴認為,這些抗體可能是最好的,具有最高性能的抗體,它們很可能會成為下一個國際標準。


Diagenode的研發工作符合國際人類表觀基因組協會(IHEC)的總體目標。IHEC聯合會給出的建議指南在任何表觀基因組項目中繪製以下6個組蛋白修飾圖:H3K4me3,H3K9me3,H3K27me3,H3K27ac,H3K4me1和H3K36me3。H3K4me3和H3K9Ac這兩種組蛋白修飾通常富集在激活的啟動子區域上;H3K4me1和H3K27Ac這兩種組蛋白修飾通常富集在基因的增強子區域;H3K36me3和 H3K79me2這兩種組蛋白修飾通常富集在RNA聚合酶延伸區域 ;H3K27me3和H3K9me3這兩種組蛋白修飾用於抑制基因表達。



鑑於對高品質抗體的要求,ChIP-seq級抗體需要建立最嚴格的QC程序。Diagenode的Premium抗體已通過眾多合作和IHEC表觀遺傳學專家社區開展的廣泛工作達到了最高驗證水平。現有抗體均經過ChIP-seq驗證,對於幾乎所有表觀遺傳應用均顯示出卓越的性能。


Diagenode廠家對ChIP-seq級別抗體進行嚴格驗證,並遵循IHEC給出的建議指南對ChIP抗體進行檢測,為您提供可以信任的抗體,如圖。


Diagenode,將生產最高質量標準的CHIP抗體作為公司經營理念的一部分,並努力不斷改進抗體的質控流程,使用高度標準化的ChIP-seq抗體檢測流程,對Diagenode Premium抗體進行全面的驗證。


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