免疫共沉澱 簡介

2021-01-10 生物谷
免疫共沉澱 簡介

來源：來源網絡 2006-12-10 21:06

蛋白質間相互作用研究方法：免疫共沉澱
1．用磷酸鹽緩衝液洗30塊10 cm培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩衝液中。
2．將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中，在微量離心機上4℃以最大速度離心15 min。
3．收集上清（約30 ml）並加入30μg的適當抗體，4℃搖動免疫沉澱物1 h。
4．加入0.9 ml的蛋白質A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉澱物30 min。
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重複洗5次。最後，用NETN洗一次。
6．吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩衝液到球珠中，煮沸4 min。
7．將樣品加入到大孔的不連續SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恆定電流下電泳過夜。
8．通過考馬斯藍染色觀察蛋白質泳帶。
9．從膠上切下目標帶，將其放到微量離心管中，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min。
10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質，再將肽電洗脫。
11． 通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序。

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