來源：來源網絡 2006-11-24 21:38
準備工作：
預冷PBS，RIPA Buffer，細胞刮子（用保鮮膜包好後，埋冰下），離心機
1. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次，最後一次吸乾PBS；
2. 加入預冷的RIPA Buffer(1ml/107個細胞、10cm培養皿或150cm2培養瓶，0.5ml/5×106個細胞、6cm培養皿、75cm2培養瓶)
3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下，把懸液轉到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15min（EP管插冰上，置水平搖床上）
4. 4℃，14000g離心15min，立即將上清轉移到一個新的離心管中
5. 準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然後用PBS配製成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠
6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景
7. 4℃，14000g離心15min，將上清轉移到一個新的離心管中，去除Protein A珠子
8. (Bradford 法)做蛋白標準曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝後，可以在-20℃保存一個月）
9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高（如10 μg/μl）
10. 加入一定體積的兔抗到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異
11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育
12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體複合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl「過渡抗體」（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）
13. 14000rpm瞬時離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體複合物，去上清，用預冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體複合物內部的結合，可以使用PBS
14. 用60μl 2×上樣緩衝液將瓊脂糖珠-抗原抗體複合物懸起，輕輕混勻，緩衝液的量依據上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）
15. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩餘瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以後電泳，電泳前應再次煮5min變性。
RIPA Buffer配製：
基礎成分：
Tris-HCl（緩衝液成分，防止蛋白變性）
NaCl（鹽份，防止非特異蛋白聚集）
NP-40（非離子去汙劑，提取蛋白；用H2O配製成10%儲存液）
去氧膽酸鈉（離子去汙劑，提取蛋白；用H2O配製成10%儲存液；避光保存）
注意：準備激酶（致活酶）實驗時，不要加去氧膽酸鈉，因為離子型去汙劑能夠使酶變性，導致活性喪失。
RIPA蛋白酶抑制劑
苯甲基磺醯氟（PMSF）（用異丙醇配製成200mM的儲存液，室溫保存）
EDTA（鈣螯合劑；用H2O配製成100mM的儲存液，PH 7.4）
亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配製成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存）
抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配製成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存）
胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配製成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存）
RIPA磷酸（酯）酶抑制劑
激活的Na3VO4（用H2O配製成200mM的儲存液，見Sodium Orthovanadate Activation Protoco）
NaF（200mM的儲存液，室溫保存）
注意：在準備做磷酸（酯）酶實驗的時候，不加磷酸酯酶抑制劑
工作液配製：
配製100ml的modified RIPA buffe：
1. 稱取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去離子水中，加入900mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用HCl調節PH值到7.4
2. 加10 ml 10%的NP-40
3. 加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清
4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
5. 理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應該在使用當天同時加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl），但是PMSF在水溶液中很不穩定，30分鐘就會降解一半，所以PMSF應該在使用前現加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩定5天。
各種成分在工作液中的終濃度：
• Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4
• NP-40: 1%
• 去氧膽酸鈉：0.25%
• NaCl: 150 mM
• EDTA: 1 mM
• PMSF: 1 mM
• 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑: 各1 µg/ml
• Na3VO4: 1 mM
• NaF: 1 mM
通過免疫共沉澱確定結合蛋白
1．用磷酸鹽緩衝液洗30塊10 cm培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩衝液中。
2．將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中，在微量離心機上4℃以最大速度離心15 min。
3．收集上清（約30 ml）並加入30μg的適當抗體，4℃搖動免疫沉澱物1 h。
4．加入0.9 ml的蛋白質A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉澱物30 min。
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重複洗5次。最後，用NETN洗一次。
6．吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩衝液到球珠中，煮沸4 min。
7．將樣品加入到大孔的不連續SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恆定電流下電泳過夜。
8．通過考馬斯藍染色觀察蛋白質泳帶。
9．從膠上切下目標帶，將其放到微量離心管中，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min。
10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質，再將肽電洗脫。
11． 通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序。
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