染色質免疫共沉澱（ChIP）技術
第一部分，什麼是ChIP技術
1.1簡介
染色質免疫共沉澱技術（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）是一種檢測在體內自然染色質環境下蛋白和DNA相互作用的有效方法。這種技術廣泛應用於檢測特定基因調節蛋白結合在基因組中的具體位置或者基因調節區域和蛋白的修飾是否相關。。因其能真實、完整地反映結合在DNA序列上的靶蛋白的調控信息，是目前基於全基因組水平研究DNA-蛋白質相互作用的標準實驗技術，日益成為研究真核細胞中轉錄調控情況的重要途徑。
1.2技術原理
在活細胞狀態下，通過在特定時間點上用甲醛交聯等方式固定蛋白質－DNA 複合物，相當於這一時間點上細胞內蛋白和DNA相互作用的關係被瞬時「快照（snapshot）」下來。並將其用Bioruptor超聲波破碎儀隨機超聲打斷為一定長度的染色質小片段，然後通過免疫學方法將蛋白質-DNA複合物與特定DNA結合蛋白的抗體孵育，將與抗體特異結合的蛋白-DNA複合物洗脫下來，最後將洗脫得到的特異DNA與蛋白解交聯，得到特異性地富集目的蛋白結合的 DNA 片段，，，通過對DNA片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與 DNA 相互作用的信息。
1.3適用研究
1.31 篩選調控蛋白在基因組上的結合靶點：針對轉錄因子、DNA/RNA 聚合酶、轉錄複合物等調控因子蛋白進行特異性的富集，分離純化與之結合的靶 DNA 片段並測序，分析篩選到準確有效的靶位點、靶基因數據；
1.32 揭示差異化表觀遺傳變異的原理：通過對不同表型組織內組蛋白、轉錄因子蛋白及其他結合蛋白進行染色質免疫共沉澱測序並定量分析靶基因表達調控水平或針對同種組蛋白進行甲基化、磷酸化、泛素化修飾所導致的結合位點變異進行分析，即可準確揭示差異化表觀變異原理；
1.33研究表觀遺傳變異疾病：藉助染色質免疫共沉澱測序技術結合生物信息分析揭示由蛋白與 DNA 相互作用變異而引起的疾病的原理，明確表觀遺傳修飾在癌症等表觀遺傳變異疾病的發生發展過程中的具體作用機制。
第二部分，ChIP實驗具體如何操作
ChIP實驗可用於研究植物動物微生物，對於動物樣品有的是組織塊（比如腫瘤樣品），有的是黏附細胞或者懸浮細胞，根據具體實驗對象ChIP實驗的步驟流程和複雜程度會有些不同，大致上是相同的。我們可以用最常用的相對簡單的動物黏附細胞作為實驗對象闡述一下具體實驗方法。
2.1甲醛交聯細胞
(1)細胞在100mm培養皿上生長到80% ~90%。當第一次使用細胞系做實驗時，另外培養兩個培養皿，一個用於預測細胞數量，另外一個用於優化超聲條件。
(2)去除上清培養液，加入lOmL 1xPBS含有終濃度為1%甲醛（加入270μL 37%甲醛到10 mL PBS)固定交聯細胞，輕柔混合後置於室溫10 ~20 min。
(3)加入1 mL 1.25mol/L甘氨酸（終濃度為0.125 mol/L)終止交聯反應，甘氨酸終止甲醛的固定作用是通過提供過量的氨基團與甲醛結合。繼續放在室溫5 min。注意：從這一步開始，把所有東西放在冰上或者4℃,包括離心步驟。
(4)吸取走上清液後，用10 mL預冷1xPBS洗兩遍後，以去除殘留的甲醛。
(5)加入4 ~5mL預冷1xPBS，能足夠覆蓋培養皿的表面，再用細胞刮棒刮落細胞, 轉移到50 ml錐形離心管，再用4~5 mL預冷1 xPBS衝洗培養皿以收集殘留的細胞。
(6)4000 rpm 離心 5 min (4℃)。
(7)去除上清，用1 mL預冷1xPBS (新鮮加入1xPIC 1O μL)懸浮細胞後，轉移到1.5 mL離心管。
(8)4000 rpm 離心5 min (4℃)得到細胞沉澱，去除上清（細胞沉澱可放於 -80 ℃冰箱保存）。
2.2染色質超聲斷裂
(1) 加入1 mLSDS裂解溶液重懸沉澱（新鮮加入1 X PIC 1O μl,在冰上放置10 min,每隔1 min顛倒搖動離心管。SDS能裂解細胞膜和核膜，使固定染色質釋放出來，這樣有利於超聲。
(2) 用公認的標準化儀器Bioruptor超聲儀把DNA打碎為長度在200 ~ 1000 bp,把樣品放在冰上操作。不同細胞樣本都得進行超聲條件優化實驗。
(3) 在超聲後，14000 rpm 離心 10 min(4℃)，轉移超聲染色質液體上清到1.5 ml 離心管。上清液可放於-80℃冰箱保存。
2.3免疫沉澱蛋白和DNA複合物
(1)使用ChIP稀釋溶液把超聲染色質液體稀釋10倍，這樣有利於免疫沉澱反應。例如200 μL超聲染色質液體加入1800 μL ChIP稀釋溶液（新鮮加入1 x PIC 20 μL)。
(2)為了減少非特異性結合蛋白背景，往2 mL超聲稀釋液中加入20 μL蛋白A/G瓊脂糖珠（Protein A/G Agarose Beads),在4℃搖床輕柔搖動1 h。
(3)1000 rpm離心2 min (4℃），轉移上清液到新的離心管，加入1〜4叫免疫沉澱抗體（每種抗體加入的量都不同）到上清液中，在4℃搖床輕柔搖動過夜。另外取 50 μL上清液，不加入抗體，作為陰性對照，以驗證檢測的特性。
2.4收穫免疫複合物（抗體-蛋白質-DNA)
(1) 40 μL ProteinA/G Agarose Beads 先用 1 mL 1 x PBS 洗 3 遍，每次洗後 1 000 rpm 離心1 min,小心吸除上清，注意不要吸走Beads。最後加40 μL 1XPBS懸浮Beads。
(2)打開樣品的管蓋，加入40 μL Protein A/G Agarose Beads。在搖床上面搖動1~2 h，4℃，以形成抗體-蛋白A免疫複合物。
(3)1000 rpm離心5min,4℃。去除上清，注意不要吸走Beads。
(4)清洗Beads:免疫沉澱複合物依次用以下所列的緩衝液洗（每個1 mL)。每次洗時，使樣品在搖床上面10min，4℃，然後再4000 rpm離心5 min。吸取上清時要注意不要吸走beads。
a.低鹽洗脫溶液1 mL洗一次；
b.高鹽洗脫溶液1 mL洗一次；
c.氯化鋰洗脫溶液1 mL洗一次；
d.TE溶液（pH 8.0) 1 mL洗兩次。
2.5洗脫免疫複合物
注意：從這一步開始，所有操作都在室溫進行。
(1)加入200 μL ChIP洗脫溶液洗脫Beads，放在搖床上室溫搖動10 min。12000 rpm，離心1 min,把上清轉移到新的1.5 mL離心管。
(2)再加入200 μL ChIP洗脫溶液洗脫Beads,放在搖床上室溫搖動10 min，一共洗脫3次，得到600 μL洗脫液。洗脫液中含有目的蛋白以及其結合的相關DNA。
2.6去除甲醛交聯
(1)加入 24μL 5mol/L NaCl 到 600μL 樣品中（NaCl 終濃度為 0.2mol/L)，包括上述1.3中的50 μL陰性對照（加入350μL ChIP洗脫溶液和16 μL 5mol/L NaCl)。
(2)65℃，過夜去除甲醛交聯。甲醛能夠在有鹽離子和去汙劑的高溫環境下解除交聯反應，使得蛋白質和DNA分離。
2.7 DNA 純化
DNA純化可以通過酚/氯仿抽提或者通過矽膠柱純化。酚/氯仿抽提
(1)對所有實驗樣本（600 μL)和50μL 陰性對照樣本，分別加入 10μg RNase A，在37℃放置30min，以去除RNA。然後加入50μg 蛋白酶K，在37℃放置1h。
(2)加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25:24:1)，混勻，12000 rpm 離心5 min。
(3)小心吸取上清液到新的1.5 mL離心管，加入 1/10體積的3 mol/L 乙酸鈉和2倍體積冰凍無水乙醇，順時針混勻後，放在-80℃冰箱1h。
(4)12000 rpm 離心 20 min，4℃。
(5)小心去除上清，注意不要吸走DNA沉澱，然後再加入70%乙醇，懸浮沉澱，12000 rpm離心10min，去除上清，讓DNA沉澱乾燥。
(6)用40 μL TE溶解DNA沉澱。
2.8染色質免疫沉澱DNA的分析和蛋白質在DNA上結合位點的鑑定
(1)如果目的蛋白的靶序列是已知的或者懷疑某個序列是目的蛋白的靶序列，可以根據靶序列設計引物，用螢光定量PCR的方法，比較特異性和非特異性免疫抗體所沉澱的DNA的PCR產物的量，或者比較根據靶序列設計的引物和遠離靶序列設計的引物的PCR產物的量。比值越大，則說明靶序列DNA與目的蛋白相結合的可能性越大。
(2)如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量研究目的蛋白在基因組的分布情況，找出轉錄因子的結合位點，可以採用DNA晶片（ChIP-chip)和ChIP-seq方法。
第三部分目的DNA如何進行檢測
3.1實時定量 PCR
用比較精確的實時定量PCR方法檢測沉澱的DNA樣品，稱為實時定量染色質免疫共沉澱技術（qChIP）。這種方法是在體內確定DNA和蛋白質相互作用。與ChIP-on-Chip方法相比，成本低廉。目前實時定量染色質免疫共沉澱技術（qChIP）已經開始應用於分析減數分裂時期蛋白質和DNA相互作用的研究。
3.2染色質免疫共沉澱測序（ChIP-SEQ ）
為了在基因組範圍內重新發現轉錄因子的結合位點，需進一步確定染色質免疫共沉澱實驗得到的DNA樣品的序列。其序列可以通過直接測序確定，這種方法稱為染色質免疫共沉澱測序（ChIP-SEQ）。ChIP-SEQ 為巨大的DNA並行序列應用快速進化平臺，以高解析度確定樣品中富集的基因組區域。目前，Illumina Genome Analyzer（GA）技術頻繁用於染色質免疫共沉澱測序（ChIP-SEQ ）應用的平臺。其它針對高通量測序的平臺是 Helicos HeliScope 和 ABI SOL- iD。
3.3 ChIP-on-chip
ChIP-on-chip是將染色質免疫共沉澱（ChIP）和DNA微陣列晶片技術相結合用來高通量分析DNA和蛋白質結合或者翻譯後染色質/組蛋白修飾的一種方法。該技術已經成為深入研究內源蛋白和DNA相互作用的有力工具。因該技術能在基因組範圍內確定轉錄因子或組蛋白修飾所在位置的染色質結合位點，故也被稱為全基因組定位分析（genome-wide location analysis，GWLS）。
該技術是將染色質免疫共沉澱與包含整個基因組或特定目的區域的晶片聯合使用，大規模地迅速確定生理條件下特定轉錄因子在染色體上的結合位點。具體方法是：將經過染色質免疫共沉澱的DNA樣品純化後進行PCR擴增，然後用螢光素標記（如 Cy3）。對沒有經過免疫沉澱反應富集的 Input DNA 樣品也進行擴增，並且用另一種螢光素標記（如 Cy5），作為結合背景的參照。之後將這兩種 DNA 雜交於包括基因組序列的微陣列晶片上，轉錄因子結合的靶序列用每個點相應的螢光強度來確定。樣品準備是影響ChIP-on- chip 結果的一個重要因素。目前常用的是覆瓦式晶片（tiling arrays），該晶片包含完全非重複性基因組。由於ChIP-on-chip 實驗數據量大，問題複雜，所以下遊的生物信息學分析相當重要。 Toedling 等人應用免費和公開的資源 R package Ringo，使 ChIP-on-chip 實驗數據的分析更便利。這個軟體能提供循環數據輸入功能，質量評價，標準化和形象化數據，檢測ChIP富集的基因組區域。
ChIP -on -chip 擴展了染色質免疫共沉澱(ChIP)技術的應用範圍，可以用於基因組功能的研究，能夠繪製基因順式調控區域和核小體位置及修飾的細節，完善真核生物的序列。這種方法首次應用在釀酒酵母的研究上，之後被應用於人細胞的研究。在醫學方面，已經應用「ChIP-on-chip」 技術確定了骨細胞的動態轉錄機制。總之，ChIP-on-chip已經成為一種在基因組範圍內研究蛋白質和DNA相互作用及轉錄調控機制的常用方法。隨著各個物種基因組覆瓦式晶片陸續發布，全基因組定位分析技術的應用將會越來越廣泛。
3.2-3染色質免疫共沉澱測序（ChIP-SEQ）和ChIP-on-chip技術的比較
ChIP是相對成熟的技術，但目前還存在一些技術難點。例如，ChIP實驗涉及的步驟多，結果的重複性較低，需要大量的起始材料；染色質免疫沉澱獲得的DNA數量往往很多，包含大量的非特異結合的假陽性結合序列；而對於神經細胞和幹細胞等，往往培養困難，並且難以區分個別細胞與總體細胞的表型。在此背景下，配合使用晶片或者第二代高通量測序技術檢測這些DNA片段，就形成了ChIP-chip技術和ChIP-Seq技術。
ChIP-Seq是將深度測序技術與ChIP實驗相結合分析全基因組範圍內DNA結合蛋白結合位點、組蛋白修飾、核小體定位或DNA甲基化的高通量方法，可以應用到任何基因組序列已知的物種，並能確切得到每一個片段的序列信息。相對於ChIP-chip技術，ChIP-Seq是一種無偏向檢測技術，能夠完整顯示ChIP富集DNA所包含的信息。ChIP-chip技術的缺點在於它是一個「封閉系統」，只能檢測有限的已知序列信息，相比之下，ChIP-Seq的優勢在於其強大的「開放性」，強大的發現和尋找未知信息的能力。因此，ChIP-Seq與傳統的ChIP-chip技術相比具有明顯的優勢：
（1）靈敏度很高。傳統的ChIP-chip實驗要求起始DNA的量在4ug以上，而一般ChIP-Seq實驗對起始DNA量的要求是10ng。這直接反映在起始細胞數目的減少，對於像早期胚胎發育相關的研究中更佔優勢。
（2）靈活性很強。ChIP-chip實驗以研究對象的特定物種的全基因組DNA晶片平臺為基礎，所以不適合應用在那些基因組序列信息不豐富或缺少相關晶片平臺開發的物種。ChIP-Seq技術則不存在這方面的限制，可以應用到任何基因組序列已知的物種，並能確切得到每一個片段的序列信息。
（3）解析度極高。傳統的微陣列晶片技術受制於當前晶片的容量，事實上不能涵蓋真正的全基因組DNA序列信息，這導致ChIP-chip的實驗結果解析度不高，精確定位蛋白與DNA的結合位點存在一定的困難。而ChIP-Seq技術輔之以強大的生物信息計算能力，可以高效地將測序得到的序列定位到特定基因組的精確鹼基位置上，解析度大大提升。
（4）不具備其它一些晶片相關的負效應，如由核酸非特異雜交帶來的噪音信號。
因此，隨著目前測序的成本不斷降低及通量迅速增高等優勢，ChIP-Seq已經基本上取代ChIP-chip成為研究轉錄因子、RNA聚合酶、核小體等DNA結合蛋白體內結合靶點的主打技術。
3.21ChIP-Seq實驗設計的關鍵主要有以下幾個方面：
1，抗體質量：一個靈敏度高和特異性高的抗體可以得到富集的DNA片段，這有利於探測結合位點。
2，空白對照：空白對照是必要的，存在很多假陽性情況需要通過空白對照進行判斷。一般來說有三種類型的空白對照：
(1) 部分進行免疫沉澱前的DNA（input DNA），這是最常用的；
(2) 由免疫共沉澱得到而不含有抗體的DNA（mock IP DNA），使用這個的問題在於收集到的量可能不夠；
(3) 使用非特異免疫共沉澱方法得到的DNA。
3，測序深度：在發表的ChIP-Seq實驗中，一般使用IlluminaGenome Analyzer上的一個lane產生的數據作為一個基本單位，目前一個lane大概是8-15million reads。判斷足夠的測序深度的標準是：當增加測序得到更多的reads時不能發現更多的東西。將這一標準應用到結合位點的數量上就是：進行測序，增加reads數而無法得到更多的結合位點。
4，Multiplexing：對於基因組比較小的物種（E.coli,C.elegans）來說，一個標準的illumina lane得到的數據太多了，僅僅測一個樣本比較浪費，所以可以將多個樣本加不同的adapter放在一起測。
由於現在提供高通量測序的服務商很多，大家只需要把經ChIP富集得到的DNA樣品純化好交給測序公司就可以了。但是大家經常會遇到測序結果信號弱，背景高等令人頭疼的問題，其實ChIP-Seq除了找一家專業的測序服務提供商以外，更重要的是如何獲取更高質量的ChIP實驗結果。
常見的兩種ChIP實驗技術有N-ChIP和X-ChIP技術。N-ChIP採用核酸酶消化染色質，適用於研究DNA與高結合力蛋白的相互作用，比如組蛋白修飾等方面的研究；X-ChIP則採用甲醛或紫外線進行DNA和蛋白交聯，通過超聲波片段化染色質，適合用來研究DNA與低結合力蛋白的相互作用問題，例如大多數非組蛋白方面的蛋白研究。
破碎DNA及具有較高的特異性和親和力的抗體是ChIP實驗成功與否的關鍵因素。大多數的ChIP實驗都使用超聲的方法打斷DNA，最理想的情況是將DNA打斷成200-1000bp的彌散片段，而不同類型及不同數量的細胞對超聲的條件都不一樣，這往往導致超聲的結果無法重複，因此，超聲要根據細胞類型和數量對條件進行摸索，將最佳超聲條件固定下來，以保持實驗的可重複性。
第四部分ChIP實驗關鍵因素有哪些
4.1 甲醛的固定交聯程度
甲醛能使蛋白質和DNA固定交聯形成複合物，能夠真實反映細胞內蛋白質和DNA相互作用情況。最好使用新鮮的甲醛，注意甲醛是否已經過了有效期。剛開始進行染色質免疫沉澱實驗時，甲醛固定的時間要進行優化。甲醛固定的時間太長，雖然會得到更多的蛋白質和DNA交聯複合物，但是需要更多時間進行超聲打碎，使得樣品溶液過熱導致蛋白質和DNA變性。另外，過度固定交聯，會使目的蛋內的抗原決定簇被屏蔽，不能和抗體結合有效結合，而引起免疫沉澱下降。甲醛固定的時間如果太短的話，蛋白質和DNA形成的複合物交聯不牢固，很容易在超聲時分離，可能在離心步驟時引起丟失。因此要對甲醛的固定時間進行優化，一般的時間為10~20 min。
4.2 超聲打碎染色質樣本所獲得的DNA片段大小
用於染色質免疫沉澱實驗的最佳DNA片段要求在超聲後為200 ~1000 bp。獲得恰當大小的DNA片段關係到實驗的成敗以及對實驗結果的解釋。因此要重視超聲條件的優化實驗。根據不同細胞類型和細胞濃度，選擇不同的超聲時間和超聲次數。最初ChIP實驗使用普通的金屬探頭式超聲儀，超聲時要把超聲針頭插入到接近離心管底部的地方，一般離底部5~10 mm,且不要碰到管壁。樣本要放在冰上進行操作，以免超聲時樣品過熱而使蛋白和DNA變性。目前大家普遍使用ChIP實驗超聲神器Bioruptor非接觸式超聲波破碎儀，由於Bioruptor超聲儀一次可以處理多個密閉樣品管進行超聲處理，樣品間不存在交叉汙染，超聲能量穩定一致，實驗重複性大大提高，徹底地完美解決了超聲問題。
4.3 抗體能否識別和免疫沉澱目的蛋白的有效性
目的蛋白抗體有效性也是染色質免疫沉澱實驗的關鍵因素。要選擇高質量,高親和力和高效價的抗體來進行實驗。先做Western Blot來檢驗在染色質免疫沉澱實驗條件下抗體是否能夠和目的蛋白的抗原決定簇結合而免疫沉澱。當抗體不能有效識別交聯中的目的蛋白時，可更換其他不同靶向抗原決定簇的抗體或者降低甲醛固定交聯時間。
第五部分超聲打斷為何推薦要使用Bioruptor超聲波破碎儀
比利時Diagenode生產的Bioruptor plus非接觸式細胞破碎儀，其超聲源是一塊附著在水槽下面的半導體金屬塊，絕非普通的壓電陶瓷。其獨特的ACT( AdaptiveCavitation Technology) 聚焦超聲技術以及高效的超聲效能，能快速處理各種樣品，得到滿意的超聲結果。
儀器標配1.5ml適配器（如上圖），可同時處理6個樣本，適配器中每個樣本的填裝體積以及濃度，更是針對ChIP或ChIP-seq技術特別優化過的，與實驗室所需的上樣量與上樣濃度完全銜接，符合實驗室需求。
自帶電磁閥式冷循環機，與超聲儀主機交錯啟動，可保證在處理測序DNA或chromatin樣本片斷化時，讓樣本處於恆定冰冷水浴條件下，同時完全不幹擾超聲波傳到到樣本的效率，其高性價比、高通量、高功率、低幹擾的優異設計，都是為了讓實驗的結果更精準、更正確、重複性更佳。
此外更考慮到實驗與應用的多元性，廠家特別設計出適合極小量樣本的0.65ml適配器，一次可以處理12個樣本，是市面上能處理體積最小的適配器，完全是讓珍貴樣本也能進行ChIP實驗特別訂製的，也徹底解決了無法處理微量珍貴樣品進行ChIP或測序實驗的困境。
Diagenode廠家提供了各種實驗的方案技巧，可以官網免費下載，或者聯繫代理商獲取，減少因為摸索超聲條件而浪費了得之不易的樣本。
儀器還含有自動過熱斷電保護及儀器壽命監控系統，可確保儀器在操作過程中的正常運作以及保護測序樣本不過熱產生質變的危險，可讓儀器正常使用情況可超聲效率維持長久不衰減。