(技術貼)染色質免疫沉澱(ChIP)實驗10大問題解答

2021-01-18 聚研生物

ChIP實驗中超聲的優化一般從如下幾個方面考慮

1  不建議重複已發表的剪切方案而不進行優化。當儀器不同於文獻中所使用的儀器時,尤其如此。


2 目前有各種超聲破碎儀器,水浴和基於探頭的。在使用基於探頭的超聲破碎儀時,選擇一個適用於您的樣品體積的探頭。


3 在任何情況下,剪切參數都應當根據您的樣品體積、細胞密度和細胞類型而優化。


4 優化應當包括功率設置(超聲時間 vs. 間隙時間/休息時間)以及獲得長度為200 – 1000 bp的DNA片段所需的剪切循環數,每個優化實驗只優化一種參數;


5 注意時間和功率設置。過度破碎和太高功率設置會損害在免疫沉澱步驟中的表位。降低ChIP信號。


6 始終保持裂解液冰冷,間斷超聲,而不是連續,因為超聲處理產生熱量會使染色質變性。


7 在超聲破碎過程中避免氣泡。泡沫會導致蛋白質的表面變性,可能使染色質損失在氣泡中。為了避免這種情況,一開始設為較低功率,再逐步提高。


8 在優化條件時,每個超聲破碎循環後通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA片段的長度。剪切不足所產生大的不溶蛋白質:DNA:RNA複合物可能堵塞瓊脂糖凝膠的孔,並延緩電泳過程。通過消化蛋白質、逆轉交聯、酚:氯仿提取和沉澱來純化DNA。


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