螢光染色是分子生物學中常用的一種實驗技術。今天，我們來淺談螢光染色的一些基本實驗步驟。這裡以細胞實驗中普通螢光染色為主，展開對實驗步驟的介紹。
對螢光信號的檢測常用的儀器主要有普通螢光顯微鏡和雷射共聚焦顯微鏡。因此，一般需要準備爬片或者是雷射共聚焦培養皿。
爬片：是一種經過特殊表面處理的玻片，常用的一般是24孔板配套的14mm直徑圓形玻片。除此之外還有6孔板，12孔板，48孔板等不同規格的爬片。經過特殊處理的爬片可以讓細胞很好地黏附，但遇到粘附性極差地細胞，要保證它們正常黏附，可以使用細胞貼壁黏附劑，促進其貼壁能力。
雷射共聚焦培養皿：是一種中間有凹槽的小皿，用它的好處在於可以省去爬片製作的流程，但也要注意的是，有的普通螢光顯微鏡是無法檢測雷射共聚焦培養皿中的細胞，所以大家也要根據實驗條件選擇適宜的載體。
選擇好載體後，接下來要做的就是細胞接種。細胞接種的密度在1*105-1*106之間，因為不同細胞生長速度不一樣，可以大致摸一下最適細胞接種濃度。將細胞以最適濃度接種於含爬片的24孔板內或者雷射共聚焦培養皿中，放入細胞培養箱24小時（培養時間可以根據需要調整），使細胞貼壁。
然後就是對細胞進行相應的處理，比如藥物啊，根據實際情況選擇。
處理結束後，用4%多聚甲醛對細胞進行固定10-15min，用PBS進行漂洗兩到三次。Triton X-100對細胞進行通透，增強細胞膜通透性，便於螢光染料進入細胞。
螢光染色：按螢光試劑盒說明書操作
復染：一般用DAPI染核（確定核的位置），DAPI染料染10min,PBS漂洗兩到三次。
封片：取出爬片。操作小技巧，最後漂洗的PBS留在孔內，不要吸出來，一手持鑷子，一手持注射針，用針尖將爬片挑起（如果能將針尖彎成一個小鉤，就更方便了），鑷子取出，在載玻片上滴上約20ul封片劑（抗螢光猝滅劑），將帶細胞一面朝下，使封片劑均勻覆蓋爬片。雷射共聚焦培養皿就無須取出爬片了。
採集圖像：普通螢光顯微鏡汞燈需要預熱，達到穩定後使用，圖像採集過程中保證對焦清晰，背景儘量是黑色，最好不要過曝，螢光容易猝滅，宜儘快採集圖像。
圖像處理;採集圖像後，我們會將DAPI和目的螢光的圖像Merge在一起。當然，有的還會計數或者分析螢光強度，可以用ImageJ軟體進行，這裡偷下懶，就不找例子介紹了。
至於免疫螢光，其他操作基本相同，常用的也是4%多聚甲醛對細胞進行固定10-15min，用PBS進行漂洗兩到三次。0.25%的Triton X-100對細胞進行通透10min，但接下來用3%左右的BSA室溫半小時對多餘位點進行封閉是普通螢光染色沒有的。
隨後就是孵育一抗，室溫1-2h或者4℃過夜，PBS洗滌，孵育帶螢光的二抗，PBS洗滌，封片（抗螢光猝滅劑）。
好了，今天就簡單介紹到這裡，如文中有疏漏或錯誤，請大家批評指正。