DAPI染色原理及DAPI染色步驟

DAPI 即4&39;,6-diamidino-2-phenylindole)，分子式為C16 H15 N5 ·2C3 H6 O3 ，分子量457.48。DAPI 為一種螢光染料，可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結合而發揮標記的作用，可以產生比DAPI自身強20多倍的螢光，和EB相比，對雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到顯藍色螢光的細胞，螢光顯微鏡觀察細胞標記的效率高(幾乎為100 %) 。DAPI染色常用於細胞凋亡檢測，染色後用螢光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。DAPI也常用於普通的細胞核染色以及某些特定情況下的雙鏈DNA染色。細胞經熱激處理後用DAPI染色3分鐘，在螢光顯微鏡下可以看到到細胞核的形態變化。

DAPI 是一種能夠與DNA強力結合的螢光染料。它結合到雙鏈DNA小溝的AT鹼基對處，一個DAPI分子可以佔據三個鹼基對的位置。結合到雙鏈DNA上DAPI分子的螢光強度提高大約20倍，常用與螢光顯微鏡觀測，根據螢光的強度可以確定DNA的量。另外，因為DAPI可以透過完整的細胞膜，它可以用於活細胞和固定細胞的染色。在螢光顯微鏡觀察下，DAPI染劑是利用紫外光波長的光線激發。單獨DAPI的更大吸收波長為340nm，更大發射波長為488nm；當DAPI與雙鏈DNA結合時，更大吸收波長為364nm，更大發射波長為454nm（10 mM Tris pH7.0，100 mM NaCl，10 mM EDTA），其發散光的波長範圍含蓋了藍色至青綠色。DAPI也可以和RNA結合，但產生的螢光強度只有與DNA結合的螢光強度的1/5，其發散光的波長範圍約在500nm左右。

利用固定劑（通常是甲醛或多聚甲醛）將細胞固定，使得細胞膜的通透性大大增加，並且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白變性，從而使通透性進一步加強。利用正常羊血清封閉，可以令許多蛋白先與血清內的非特異性抗體結合，而特異性的抗體由於動力學的關係可以通過競爭性的反應與目的蛋白結合，這一過程可以保證抗體識別的特異性。二抗可以特異性識別一抗的Fc區域，利用二抗連接不同的螢光基團，就可以在螢光顯微鏡下觀察到不同的螢光，從而顯示目的基因的表達情況。另外，免疫螢光實驗由於其較高的敏感性可以顯示出基因表達的亞細胞情況(核內，核外，膜上以及一些較大的細胞器上)，所以通常被用來作為基因定位的方法。

固體粉末 ：避光，2-8 ℃保存，3年沒有問題。貯存液 ：用無菌水配製成濃度1 mg/ml 的貯存液，配好後用錫紙包起來，避光，可在-20 ℃下長期保存。（DAPI易溶於水，在PBS中溶解度不高）使用濃度 ：貯存液用1xPBS稀釋到終濃度100 ng/ml。螢光封片液 ：0.5 mol/L碳酸鹽緩衝液與甘油等體積混合，pH9.5染色與觀察 ：制好的玻片上滴加幾滴DAPI染液，染色10分鐘，流水衝去染液，濾紙吸除多餘水分，加一滴螢光封片液，置於螢光顯微鏡下觀察，激發波長360-400nm。注意事項 ：DAPI可能具有致癌性，全部操作過程中必須帶塑料或乳膠手套。

DAPI染色DNA

1)在染色前的細胞密度約是0.8X105/孔（293T細胞/六孔板每孔）。2)移去完全培養基，用PBS清洗一次。3)用10％的甲醛溶液或者4%的多聚甲醛PBS在室溫固定20分鐘。4）用PBS在室溫漂洗三次，每次10分鐘。5）用含0.5%Triton-X-100的PBS在室溫通透化處理15分鐘。6）用PBS在室溫漂洗三次，每次10分鐘。7）在室溫用含10%NGS的PBS封閉1小時，或者在4攝氏度封閉過夜。8）在37攝氏度用特異性一抗孵育半小時，或者在室溫下孵育一小時以上或者4攝氏度孵育過夜。9）用含0.1% Tween-20的PBS在室溫漂洗三次，每次10分鐘。10）用鋁箔包裹後在37攝氏度用二抗孵育半小時以上，或者在室溫下孵育一小時以上。11）去除二抗，加入DAPI染色液室溫作用15分鐘以上。12）用含0.1% Tween-20的PBS在室溫漂洗三次，每次10分鐘。13）在螢光顯微鏡下觀察，用合適波段激發，照相保存實驗結果。

DAPI染色

1．溶液配製

(1)0．01mol／L PBS(pH7．0)：取0．1mol／L NaH2PO4・H2O 34ml、0．1mol／LNa2HPO4 66ml、NaCl 0．9g，溶於900m1雙蒸水；

(2)DAPI儲存液：將0．5mgDAPI溶於5．0ml PBS中，分裝，低溫長期保存；

(3)DAPI工作液：用PBS稀釋DAPI儲存液，終濃度為0．1ug／ml。

2．染色程序

(1)培養的單層細胞(未固定)或新鮮組織的冰凍切片等，PBS漂洗5分鐘；

(2)DAPI工作液室溫染色5～20分鐘(可根據實驗材料的染色結果而定)；

(3)PBS漂洗；

(4)水溶性封片劑封片，游離細胞也可直接用含DAPI的PBS封片；

(5)螢光顯微鏡觀察。

結果：正常的細胞核呈強螢光，細胞質無螢光；固定的組織細胞同樣處理，亦可得到相似的染色結果。在有支原體汙染的細胞質和細胞表面可見孤立的點狀螢光，在感染痘苗病毒的細胞質中存在獨特的「星狀」螢光簇(star-like fluorescent clusters)，腺病毒感染早期胞質中也可出現螢光。

dapi染色觀察到藍色螢光是活細胞還是死細胞？DAPI染色不能區分活死細胞，因為DAPI可以透過完整的細胞膜，它可以用於活細胞和固定細胞的染色。活細胞死細胞都能夠被DAPI染色，所以光看到藍色螢光，無法區分。DAPI是一種能夠與DNA強力結合的螢光染料，常用於螢光顯微鏡觀測。類似於DAPI技術，赫斯特染色是一種既可以用於活細胞也可以用於固定細胞的藍色螢光染料，並且可以使用與DAPI相同的機器濾鏡設置。

dapi染料的激發光波長和發射光波長光譜圖：

dapi染料的激發光波長和發射光波長光譜圖