姐妹染色單體分化染色方法

姐妹染色單體分化染色方法

來源：來源網絡 2007-03-10 20:35

姐妹染色單體差別染色可使中期染色體顯示深淺不同的兩條單體，能藉以觀察姐妹染色單體互換（SCE）現象。SCE是兩條染色單體在DNA合成中核苷酸序列發生互換而表現出來一種現象。即是細胞分裂是DNA同源重組的結果。SCE既是一種無害的變化（有生理波動），也可受射線、致突和致癌物三因素等作用而升高。SCE一定成度反映細胞的損傷與修復狀態。
1、原理：
　　在細胞培養過程中，加入一定是的5-溴脫氧尿苷（BudR ）,當細胞在DNA複製過程時，BudR能作為核苷酸的前體取代胸腺嘧啶而被摻入到新合DNA中。因此，當細胞處於第二個分裂周期時，同一染色體的兩條姐妹染色單體，一條由雙股都含有BudR的DNA鏈構成，而另一條為單股含有BudR的DNA鏈。在結構上雙股含BudR的DNA螺旋化程度較低，故對染色劑親合力低，在用Giemsa染色時其單體著色淺，只有單股含BudR的DNA鏈組成的單體則著色深而形成差別著色。
2、BudR貯存液的配製：
　　BudR 5mg（先用0.5ml 1N NaOH溶解）
　　然後加蒸餾水至 5ml
　　即成1000ug/ml的貯存液，因BudR遇光會發生分解，貯存液需置棕色瓶並黑紙封瓶避光冰凍保存。
3、實驗材料：
　　所檢培養細胞；
　　BudR貯存液；
　　2×SSC液；
　　常規染色體製片所需物品；
　　水浴鍋；
　　20W紫外燈一個；
　　培養皿；
　　鏡頭紙；
4、操作程序
　　（1）BudR摻入：細胞培養24小時後於培養液中加入BudR，最終濃度5-15mg/ml，避光條件下繼續培養。
　　（2）終止培養：待細胞經歷兩個細胞周期（48小時），培養終止前3小時加秋水仙素，秋水仙素終濃度為0.02ug/ml培養液；
　　（3）常規製片及烤片；
　　（4）紫外燈照射：取標本玻片置於大號培養皿內，正面朝上，上覆蓋鏡頭紙，從玻片外鏡頭紙邊沿加2×SSC液致使全鏡頭紙浸溼，移入50-60℃水浴鍋內，紫外線燈距離5cm，照射30-40分鐘；
　　（5）染色：取出照射後標本，蒸餾水衝洗，置PH6.8的2%Giemsa染色15分鐘；
　　（6）洗片及存片：同G帶片
　　注意：BudR是一種強突變劑，使用濃度不宜過高，否則會產生細胞毒性作用。

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