革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑑別染色法，1884年由丹麥醫師Gram創立。未經染色之細菌，由於其與周圍環境折光率差別甚小，故在顯微鏡下極難觀察。染色後細菌與環境形成鮮明對比，可以清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些結構特徵，而用以分類鑑定。革蘭氏染色屬復染法。
步驟
革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，
具體操作方法是：
1）塗片固定。
2）草酸銨結晶紫染1分鐘。
3）自來水衝洗。
4）加碘液覆蓋塗面染約1分鐘。
5）水洗，用吸水紙吸去水分。
6）加95%酒精數滴，並輕輕搖動進行脫色，20秒後水洗，吸去水分。
7）蕃紅染色液（稀）染1分鐘後，自來水衝洗。乾燥，鏡檢。
原理
通過結晶紫初染和碘液媒染後，在細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的複合物，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯緻密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，
因此能把結晶紫與碘複合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑後，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而鬆散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘複合物的溶出，因此通過乙醇脫色後仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
染色的差異主要是由於陰性與陽性細菌細胞壁的差異所引起的。
1.革蘭氏陽性細菌的細胞壁 G+細菌細胞壁具有較厚（20-80nm）而緻密的肽聚糖層，多達50層，佔細胞壁成分的40%～95%，它同細胞膜的外層緊密相連。有的G+細菌細胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也稱胞壁質（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或胺基酸的酯而存在。由於磷壁酸帶負電荷，它在細胞表面能調節陽離子濃度。磷壁酸與細胞生長有關，細胞生長中有自溶素（autolysins）酶類起作用，磷壁酸對自溶素有調節功能，阻止胞壁過度降解和壁溶。 如果細胞壁的肽聚糖層被消溶，G+細胞成為原生質體（protoplasts），細胞壁不復存在，而只存留細胞膜。除鏈球菌外，大多數G+細菌細胞壁中含極少蛋白質。
2.革蘭氏陰性細菌的細胞壁 G—細菌細胞壁比G+細菌細胞壁薄（15～20nm）而結構較複雜，分外膜（outer membrane）和肽聚糖層（2～3nm）。在細胞壁和細胞質膜之間有一個明顯的空間，稱為壁膜間隙（periplasmic space）。 外膜 G—細菌細胞壁外膜的基本成分是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），它同細胞質膜相同之處也是雙層類脂，但除磷脂外還含有多糖和蛋白質。 LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特異多糖。O-特異多糖由重複分支的碳水化合物分子組成，含有已糖（葡萄糖、半乳糖和鼠李糖）和二脫氧已糖。由於糖的種類不同，使各種G—細胞具有不同特性的LPS。核心多糖（corepolysaccharide）的主要組分是酮脫氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）。外膜中還含有幾種蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用（porin），調控外界分子進入細胞；有的蛋白分子可以作為噬菌體的受體；許多G—細菌對高等生物有致病性是由LPS的成分決定的，它的毒性組分常稱為內毒素（endotoxins）。 肽聚糖層 G—細菌細胞壁的肽聚糖層很薄，在大腸桿菌和其它細菌中僅有單層。
肽聚糖層和外膜的內層之間通過脂蛋白連接起來。 壁膜間隙 G—細菌細胞壁的外膜與細胞質膜之間存在明顯的壁膜間隙，一層薄的肽聚糖處於其間，肽聚糖層和細胞質膜之間的間隙較寬，肽聚糖層至外膜之間的間隙較窄。大腸桿菌的壁膜間隙寬度為12～15nm，呈膠腖態。其間含有三類蛋白質：水解酶，催化食物的初步降解；結合蛋白，啟動物質轉運過程；化學受體（chemoreceptors），在趨化性中起作用的蛋白。
染色結果
革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。
抗酸染色法acid－fast staining method 1882年由埃利希（F．Ehrlich）首創並經F．齊爾（Ziehl）改進而創造出的細菌染色法。
抗酸染色的原理
分枝桿菌的細胞壁內含有大量的脂質，包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結合後，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。
齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復紅牢固結合成複合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。當再加鹼性美蘭復染後，分枝桿菌仍然為紅色，而其他細菌及背景中的物質為藍色。
抗酸染色一般步驟
1）初染 用玻片夾夾持塗片標本，滴加石炭酸復紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現蒸汽即暫時離開，若染液蒸發減少，應再加染液，以免乾涸，加熱3-5分鐘，待標本冷卻後用水衝洗。
2）脫色 3%鹽酸酒精脫色30秒~1分鐘；用水衝洗。
3）復染 用鹼性美蘭溶液復染1分鐘，水洗，用吸水紙吸乾後用油鏡觀察。
抗酸染色的染液配製
1、石炭酸復紅 鹼性復紅酒精飽和溶液 10mL 5%石炭酸 90mL
2、3%鹽酸酒精 濃鹽酸 3mL 95%酒精97mL
3、呂氏美蘭液 美蘭酒精飽和液 30mL 氫氧化鉀（1:10000）100mL
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