一、原理：
通過結晶紫初染和碘液媒染後，在細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的複合物，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯緻密，故遇乙醇脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此能把結晶紫與碘複合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑後，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而鬆散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘複合物的溶出，因此通過乙醇脫色後仍呈無色，再經番紅等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
二、步驟
革蘭氏染色法的步驟為：塗片→固定→結晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脫色→番紅復染→水洗→乾燥→觀察。
1、塗片
首先在載玻片上滴一小滴蒸餾水，用灼燒過的接種針挑取少量細菌，置於載玻片的水滴中與水混合併塗抹開。注意塗抹要均勻平坦，塗抹成直徑約為1 cm的薄層。
2、固定
將載玻片在火焰上方快速來回通過一兩次，以載玻片的加熱面接觸手背皮膚，不覺過燙為佳；待冷卻後再在火焰上方來回通過一兩次，再冷卻，重複操作直到薄層變幹。
3、結晶紫染色
染色1分鐘，然後水洗並用吸水紙吸乾。
碘液媒染 染色1分鐘，然後水洗並吸乾。
4、酒精脫色
用95%酒精脫色，直到酒精不出現紫色時即停止（大約半分鐘），然後立即水洗，並吸乾。
5、番紅復染
染色3分鐘左右，然後水洗並吸乾。
6、鏡檢
在顯微鏡油鏡頭下觀察，菌體顯藍紫色的為革蘭氏陽性菌；菌體顯紅色的為革蘭氏陰性菌。
三、結果
染色結果革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。
四、意義
1、鑑別細菌
2、選擇藥物
3、與致病性有關
革蘭氏陽性菌能產生外毒素，革蘭氏陰性菌能產生內毒素；而內毒素主要是指革蘭氏陰性菌胞壁成分中的脂多糖，兩者的致病作用不同。
五、注意事項
1、注意塗片不宜過厚，勿使細菌密集重疊，影響脫色效果，否則脫色不完全造成假陽性。鏡檢時應以視野內分散細胞的染色反應為標準。
2、火焰固定溫度要適宜，以玻片不燙手為宜，否則菌體細胞變性。
3、滴加染色液與酒精時一定要覆蓋整個菌膜，否則部分菌膜未受處理，亦可造成假象。
4、乙醇脫色是革蘭氏操作的關鍵環節。如脫色過度，則G+被誤染成G-菌，而脫色不足，G-被誤染成G+菌。在染色方法正確無誤的前提下，如菌齡過長、死亡或細胞壁受損傷的G+也會呈陰性反應，故革蘭氏染色用要對數生長期的幼齡培養物。
5、染色過程的時間控制。應根據季節、氣溫調整。一般冬季時間可稍微長些，夏季可稍微短些。