革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：
在乾淨的載玻片中央滴加一滴蒸餾水，用接種環進行無菌操作，挑取培養物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成菌懸液並塗布成直徑約1cm的薄層。為避免因菌數過多聚集成團，不利於觀察細菌個體形態，可在載玻片一側進行上述操作，而在另一側再加一滴水，從已塗布的菌液中再取一環於此水滴中進行稀釋，塗布成薄層。若材料為液體培養物或固體培養物中洗下製備的菌液，則直接塗布於載玻片上即可，如菌液濃度較大，也可使用水滴再進行一次稀釋。
塗片最好在室溫條件下使其自然乾燥，有時為了使之幹得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈火焰上方較高的位置微微加熱，使水分蒸發，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。
標本乾燥後即進行固定，固定的目的有三個：
(1)殺死微生物，固定細胞結構。
(2)保證菌體能更牢固的粘附在載玻片上，防止標本水洗時被水衝洗掉。
(3)改變染料對細胞的通透性，因為死的原生質比活的原生質易於染色。
固定常常利用高溫，手執載玻片的一端(塗有標本的遠端),標本向上，在酒精燈火焰外層儘快的來回通過3-4次，共約2s-3s,並不時以載玻片背面加熱，載玻片背面觸皮膚，以不覺過燙為宜(不超過60℃),待放置冷後，再進行染色。
在固定過的塗片菌膜上滴加草酸銨結晶紫染液，染色液應完全覆蓋整個菌膜，染色1min。
染色到一定的時間，拿住玻片使之成450角，用細小的水流把多餘的染料衝洗掉，被菌體吸附的染料則保留。
加碘液覆蓋塗面染1 min。在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性的化合物，可增加染料和細菌的親和力。
用細小的水流緩慢衝洗塗片上的染色液，用吸水紙吸乾。
加95%酒精數滴，並輕輕搖動進行脫色， 20 s~30 s後再進行水洗，吸去水分。
蕃紅染色液染色10 s後， 自來水衝洗。
染色的結果，革蘭氏正反應菌體都呈紫色，負反應菌體都呈紅色。
(1)水流衝洗時，將載玻片微微傾斜，讓水流從塗菌處的上方而不要直接在塗菌處衝洗，同時應調小水流避免染色液飛濺。染色液如果滴在水池或桌面上，可以用84消毒液擦拭去掉顏色，但要注意84消毒液不可直接用於皮膚和衣物等。
(2)在實驗中經常會出現假陽性和假陰性的結果，假陽性主要是由於脫色不完全，可能是由於塗片過厚或者是結晶紫染色過度等，導致脫色不完全。假陰性可能是因為細胞固定過度，造成細胞壁通透性的改變，而出現假陰性結果；另外，細胞培養時間過長，可能已經有部分細胞發生死亡或自溶，也導致細胞壁通透性的改變而出現假陰性的結果。避免假陽性或假陰性的辦法是在同一張載玻片上設置革蘭氏陽性菌(如金黃色葡萄球菌) 和革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌)的對照與待染色的菌一起進行染色， 當對照菌呈現預期的染色結果時表明染色過程正常。
(3)所觀察的細胞一般應用18 h~24 h的活力培養物。因為一此菌株隨菌齡的變化在革氏染色反應和形態學上也會發生變化。