手把手教你做組織免疫螢光染色

小師妹最近在學做小鼠腦組織免疫螢光，圖片一塌糊塗，不是背景過強就是染不上螢光，越做越沮喪，感覺世界背叛了她。還好她有一個我這麼外貌與智慧並存的師兄，手把手傳教。看完你要不要skr一下？

萬丈高樓拔地起，關鍵在於基礎打的好，所以組織免疫螢光實驗前組織樣品製備極其重要。組織樣品（腦、腎、心臟和其他器官）最好是經過心臟灌流固定，使細胞內的各種物質儘可能保持在其生活狀態時的形態結構和位置；另外，組織固定後，具有硬化作用，增加了組織的韌性，有利於取材和組織脫水，如果樣本沒有及時固定或固定不恰當，導致自溶或腐敗，將無法逆轉。

1、將麻醉後的小鼠仰面朝上固定四肢。V字形剪開腹部，剪至胸膜處，打開胸腔，暴露出心臟。

2、從小鼠左心室尖將針頭（鈍化處理）插入左心室，用剪刀剪破右心耳，使血液流出，將針頭插至主動脈，止血鉗固定針頭。快速灌注0.9%生理鹽水，至無血液排出，四肢、肝臟變白為止，時間維持在5 min左右。

小鼠灌流示意圖(摘自網絡）

3、更換裝有冰冷4% 多聚甲醛（PFA）的針管，灌流固定。開始階段會出現尾巴向腹部翹起、四肢肌肉顫抖現象，此時降低灌注速度，以使固定充分。至肝臟、四肢變硬為止，灌注60 ml左右，時間維持在10 min左右。

4、取組織器官置於冰冷的4% PFA中，24 h後，將組織轉移至30%的蔗糖溶液中，脫水3 d以上。脫水完全時，組織會沉入底部，可兩天更換一次蔗糖水。

以上步驟可以保證組織充分固定。另PFA有毒，需做好防護。

然後進行切片和螢光染色。切片要保證均勻、完整、損傷低。螢光染色是本實驗的關鍵，選擇合適抗體，操作要輕柔，以防止機械損傷。正式實驗前，建議進行預實驗，以確定最佳抗體濃度。

1、切片。一定要保證樣品充分固定和脫水後再切片。用冷凍切片機冠狀切片，厚度為20-30 μm。收集在0.01M PBS中，4℃保存。也可放入凍存液中，-20℃中可長期保存。

2、挑片。挑選所需組織切片，注意要選取完整，位置準確的切片，同時避免在挑選時損傷切片。置於PBS中，搖床上漂洗3次，5 min/次。可使用24孔板進行漂洗，方便快捷。

3、封閉。將組織切片置於封閉液（0.01 M PBS，0.3% Triton X-100，3%山羊血清，原則上儘量選擇與二抗種屬同源的血清，切記不可使用與組織源相同的血清）中，室溫、搖床慢搖、通透、封閉1 h。

4、一抗孵育。所有一抗使用10%山羊血清稀釋。稀釋比例根據抗體效價、組織蛋白表達情況決定。一抗4℃孵育過夜。將組織切片置於PBS中，搖床上漂洗4次，10 min/次，洗掉非特異結合的抗體。

5、二抗孵育。加入二抗（1:1000 PBS稀釋，我們通常使用的是Invitrogen的螢光二抗），室溫、避光、搖床孵育2 h。注意二抗濃度的使用，避免濃度過高。將組織切片置於PBS中，避光搖床上漂洗3次，10 min/次。

6、貼片。防淬滅封片劑封片，避光風乾，共聚焦顯微鏡觀察、拍片記錄、結果分析。共聚焦顯微鏡的使用也是尤為重要的，一定要在使用前熟練掌握技術，再進行實驗。以免最後捕捉不到最佳圖片，前功盡棄。

按照以上步驟和注意事項，注意細節，這樣你就可以做出漂亮的免疫螢光圖片啦。加油哦，先把預實驗做起來!

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